DSC

Protocolos Clínicos de Diagnóstico
Serológico Comentado.- Núm. 8

Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio Fuertes Ortiz de Urbina

Cortesía de Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica, S.A.

INFECCIÓN POR EL VIRUS EPSTEIN-BARR

Versión 1.Mayo 1998

Introducción

El virus Epstein-Barr (EBV) es un Herpes virus humano tipo 4, linfotrópico, en cuyas células establece su infección latente. Se ha demostrado que este virus es el principal responsable de la Mononucleosis Infeciosa (MI), enfermedad de la adolescencia y de la infancia. Además puede producir ciertas formas de cáncer, como el Carcinoma de Nasofaringe Indiferenciado (CNI), el Linfoma de Burkitt Endémico (LBE), o linfomas de células B en pacientes con inmunodeficiencias adquiridas o congénitas y existe una gran controversia sobre el papel de este virus como causa de enfermedad crónica, en especialmente en lo que respecta al Síndrome de Fatiga Crónica (SFC).

Estructura

Como todos los de la familia es un virus grande, encapsulado y con una doble cadena de DNA. Mide unos 150 nm. Su cápside es icosaédrica con 162 capsómeros y todo el virus esta envuelto por una cubierta con glicoproteínas. El espacio que existe entre la cubierta y la cápside, tegumento, está lleno de proteínas y enzimas de origen viral. Es sensible a los ácidos, disolventes, detergentes y desecación. El genoma está formado por una doble cadena de DNA lineal de distinto tamaño. Tiene dos secciones, una larga (UL) y otra corta (UC), flanqueadas cada una de ellas por dos grupos de repeticiones directas de DNA (LR) por lo que, a diferencia de otros tipos de virus herpes con grupos de repeticiones indirectas, solo muestra una configuración isomérica.

Replicación

Los procesos moleculares de replicación de los herpes virus están regulados por factores virales y celulares. De forma esquemática diremos que la síntesis de proteínas virales se lleva a cabo en tres fases: 1) síntesis inmediata precoz de proteínas primarias necesarias para la síntesis de ácidos nucleicos y resto de proteínas virales, 2) síntesis de proteínas específicas y genóma viral y 3) síntesis tardía de proteínas estructurales y 4) Los factores virales y celulares determinan si el virus provoca una infección lítica, persistente o latente.

Estructura Antigénica

Cuando se produce la infección celular comienza la producción de proteínas virales. Estas proteínas incluyen los antígenos Tempranos (EA), los de cápside (VCA) y las glicoproteínas de membrana (MA). En la Tabla 1 se describen las características más importantes de estos antígenos.

Patogenia y Persistencia Viral

El virus es transmitido mediante saliva infectada y alcanza las células epiteliales de la orofaringe en donde se replica con producción de viriones y lisis celular. Las células B son infectadas a su paso por la orofaringe o el epitelio del espacio postnasal. El virus utiliza para contactar con la célula una de las proteínas de su envoltura, gp350, que se une al receptor celular CD21 (el mismo que tiene para el C3d del complemento). La mayoría de los anticuerpos producidos durante la infección están dirigidos contra esta proteína y han existido ya intentos para desarrollar con ella una vacuna frente a esta infeccíon. En la fase aguda solo un reducido número de células B permite la replicación viral con expresión de todos los antígenos virales, la formación de viriones y en último caso la lisis celular. La mayoría de ellas expresan solamente un número limitado de genes y no permiten en este momento la replicación viral (Infección latente). En algún momento de esta fase latente alguna de estas células puede entrar en actividad y permitir un ciclo completo replicativo. En la fase aguda las células infectadas son controladas por las NK y los linfocitos T que proliferan en gran cantidad, este aumento celular es el responsable del aumento de tamaño de los gánglios linfáticos, bazo e hígado que pueden verse en la fase aguda de la infección. En la fase de convalescencia y latencia son estos últimos el mecanismo más importante de vigilancia y control. Las personas inmunocompetentes mantienen el VEB en los linfocitos B como una infección crónica latente la cual le ayuda a sobrevivir y a transmitirse a nuevas células del huésped. Esta larga convivencia es posible gracias a que el virus desarrolla diferentes mecanismos para escapar a la acción del sistema inmune. Durante la fase aguda el virus expresa los productos de unos 90 genes mientras que en la fase latente solo son expresados los antígenos EBNA y LPM2 (EBNA 1,2,3A,3B,3C y las LPM relacionadas con la transformación celular 1,2Ay 2b). EBNA1 es necesario para que se automantenga el DNA en los linfocitos que se activan y LPM2 permite al virus permanecer latente limitando la expresión de genes en la membrana. Esta mínima expresión del repertorio de proteínas virales permite al virus minimizar el número de blancos para el sistema inmune. Otro mecanismo de defensa consiste en la expresión del gen BCRF1 que produce una proteína, EBV IL-10, similar en un 80% a la interleucina 10 (IL-10). De esta manera el virus produce una inhibición en la producción de Interferón y la síntesis de IL-1 e IL-12 con la consiguiente alteración de la diferenciación de los linfocitos B. El tercer mecanismo que puede emplear el VEB para persistir consiste en su capacidad para disminuir la producción y expresión de HLA I así como también de "proteínas transportadoras" en las células infectadas igualmente parece que EBNA1 puede inhibir el mecanismo de procesado de los antígenos virales. De esta forma se consigue una disminución de la expresión antigénica en las membranas celulares y una protección frente al poder destructor de los linfocitos T8.

Epidemiologia

Es un virus de amplia distribución, estimándose que cerca del 90% de los adultos han sido infectados. Se piensa que el 70% de la población se infecta antes de los 30 años. La seroepidemiología ha demostrado que en los países poco desarrollados la infección asintomática en los primeros años de la vida es lo más frecuente mientras que, por el contrario, en los países con mejor nivel de vida muchos individuos se escapan de la infección primaria hasta la adolescencia. Cuando la primoinfección se retrasa el virus tiene tendencia a producir síntomas.

Sindromes Clínicos

La Mononucleosis infecciosa es la más típica forma clínica de la infección primaria por el EBV. Como sucede con los demás HV, la infección en niños es mucho más leve que la que se produce en adolescentes o adultos. El tiempo de incubación de alrededor de un mes. Después de un período prodrómico, caracterizado por escalofríos, sudoración, fiebre y malestar, se presenta la enfermedad, que en su forma más típica incluye la tríada de odinofagia, fiebre y linfadenopatías. También aparecen con frecuencia hepatoesplenomegalia y exantema. La mayoría de los casos remite de forma espontánea a las 3 o 4 semanas, aunque el cansancio puede durar un poco más tiempo. Existen algunas complicaciones importantes con alteraciones neurológicas ( meningoencefalitis y Guillain Barré), obstrucción laringea o rotura de bazo. En la gran mayoría de casos la recuperación es total mediante tratamiento sintomático.

Dado que el virus inmortaliza o transforma los linfocitos en cultivo, siempre se ha sospechado la participación de este agente en el Linfoma de Burkitt Endémico. Este linfoma endémico de algunas regiones de Africa presenta en sus células viriones y secuencias de ADN del virus. Se pensó que EBV actuaría por activación del oncogen c-myc, por la presencia de un gen en el propio del virus. Recientemente se sospecha que el papel que este virus desempeña es el de cofactor ya que en los LB esporádicos no se encuentran secuencias del virus. Parece ser que la infección por plasmodium, que produce una importantísima alteración del papel "vigilante" de los linfocitos T, puede ser el factor principal del desarrollo de este tumor en estas zonas endémicas.

La respuesta serológica característica en pacientes con Carcinoma Nasofaringeo Indiferenciado también lo ha asociado con este virus. A diferencia del LBE las células que componen este tumor, también endémico de extremo oriente, son de estirpe epitelial. Nuevamente se piensa que existe además otro factor que interviene en el desarrollo de este tumor. Los ésteres de phorbol , una hierba medicinal muy utilizada puede ser el cofactor.

Cada vez hay más pruebas de que la inmunosupresión o la alteración de la función de los linfocitos T favorece la aparición de Enfermedades Linfoproliferativas en pacientes infectados por VEB. La leucoplasia peluda de los pacientes VIH positivos es un ejemplo.

El Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) con cansancio crónico, febrícula, debilidad muscular e incapacidad para concentrarse se ha intentado relacionar con este virus. La única prueba de esta asociación la constituye en una cierta elevación de los títulos de anticuerpos frente al virus. También se ha descrito este cuadro en asociación con otros virus y la importancia que el paciente dio a su enfermedad. Por todo ello no está clara esta asociación .

Diagnostico de la infeccion

En general, el mejor procedimiento para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones víricas es el aislamiento del virus o de alguno de sus componentes o productos. Aunque se reconocen tipos celulares naturalmente susceptibles a la infección por el EBV, in vitro se reduce prácticamente a linfocitos B, que son transformados, en un proceso lento y tecnológicamente complejo, por lo que el aislamiento es un procedimiento iimposible para la gran mayoría de laboratorios de diagnóstico. La identificación de antígenos del virus tampoco ha resultado una aproximación adecuada. Por último, la detección de DNA del virus por la reacción en cadena de la polimerasa ha mostrado un buen rendimiento comparativo con los estudios serológicos para el diagnóstico de la mononucleosis en la fase aguda.

DIAGNÓSTICO INDIRECTO

Dados los inconvenientes del diagnóstico directo, las infecciones por el EBV se realizan de forma fundamental mediante estudios serológicos.

Anticuerpos heterófilos

Desde mucho antes de la descripción del virus y de su relación con la mononucleosis infecciosa, se aplicaba el test de Paul-Bunnell para la identificación de anticuerpos heterófilos (AH). Estos son anticuerpos IgM dirigidos contra antígenos presentes en la superficie de eritrocitos de diferentes especies, y que aparecen en más del 80% de casos de adultos y de forma menos frecuente (menos del 50%) en niños. Sin embargo, y a pesar de no corresponder a una respuesta específica contra el virus, sí son bastante específicos de la enfermedad producida por el virus.

En la actualidad se emplean diversas aproximaciones para detectar AH, desde la más clásica de aglutinación de eritrocitos bovinos, ovinos o equinos, después de la absorción diferencial con extracto de riñón de cobayo, hasta técnicas de ELISA o de aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con antígenos de membrana de eritrocitos bovinos, que ofrecen mayor facilidad para la interpretación de resultados. Todos presentan un rendimiento similar. Existen algunos trabajos que indican que los métodos de aglutinación son más sensibles que los inmunoensayos con una especificidad equivalente.

Respuesta serológica específica

El EBV tiene una gran complejidad antigénica. Se distinguen tres clases de sistemas antigénicos: antígenos de la fase latente, antígenos replicativos tempranos y antígenos tardíos (Tabla 1). No todos son importantes para el diagnóstico. Entre los primeros, existen los antígenos nucleares del EBV (EBNA1 y 2). A pesar de ser los primeros en aparecer la respuesta de anticuerpos a EBNA-1, que se produce en todos los individuos infectados, es un marcador tardío de infección. Entre los antígenos tempranos (EA) y en función de su localización se distinguen dos tipos: difuso (EA-D, en núcleo y citoplasma) y restringido (EA-R,sólo en citoplasma). La respuesta de anticuerpos anti-EA no es universal e indica que la célula ha entrado en un ciclo lítico y productor. Por último, entre los tardíos, el antígeno de la cápside del virus (VCA) se expresa abundantemente en la infección igualmente lítica y productiva, e induce una respuesta del isotipo IgM en la enfermedad primaria que dura 2-3 meses, y del isotipo IgG, que permanece detectable durante toda la vida. (Tabla 2).

Técnicas y antígenos empleados en el diagnóstico indirecto.

Para la caracterización serológica específica, los métodos considerados como de referencia han sido las técnicas de inmunofluorescencia, indirecta (IFI) para IgG e IgM anti-VCA, e IgG anti-EA, y anticomplemento (IFAC) para anti-EBNA. Los métodos indirectos se desarrollan sobre portas que contienen células que expresan casi en exclusividad los antígenos que interesen. En el caso de VCA la línea celular más frecuentemente empleada es la P3HR1, para IgG anti-EA se emplea la línea Raji químicamente inducidas para optimizar la expresión del antígeno, inhibiendo la producción de viriones.. Para evitar las interferencias derivadas de la presencia de factor reumatoide, las determinaciones de IgM anti-VCA se deben realizar después de eliminar la IgG de la muestra, para lo que el procedimiento más empleado es el uso de un antisuero anti-IgG humana. El método IFAC para anticuerpos anti-EBNA se aplica sobre muestras inactivadas por calor (56ºC, 30 min). Un aspecto crítico en las determinaciones de anticuerpos frente a EBNA es que los pocillos no se deben secar entre incubaciones, dado que se pueden obtener resultados negativos falsos.

Con estas técnicas en el curso de la infección primaria se producen respuestas anti-VCA, tanto del isotipo IgM como IgG, de forma prácticamente simultánea. En la mayoría de casos alcanzan el pico en el momento en que aparece la sintomatología, o en pocos días después, por lo que en la mayor parte de los casos no es posible detectar seroconversión de IgG. Entre 2 y 3 meses después del comienzo de la enfermedad, la respuesta IgM cae a niveles indetectables, en tanto que la IgG permanece a buenas concentraciones durante toda la vida del individuo. Una parte importante de pacientes (cerca del 85%) desarrolla IgG frente al componente difuso del antígeno temprano (EA-D), cuyo pico se alcanza unos pocos días después del comienzo, y que desaparece usualmente a los pocos meses. Los anticuerpos frente a EBNA aparecen semanas o incluso algunos meses después del comienzo de la enfermedad.

Así pues, el perfil de anticuerpos de la primoinfección por el EBV se caracteriza por la presencia de respuestas IgG e IgM frente al antígeno de la cápside, en ausencia de anticuerpos anti-EBNA . Este perfil se presenta en más del 90% de los casos de MI causados por el EBV. En algunos pocos pacientes aparecen patrones anormales con una aparición temprana de anti-EBNA y en otros no es posible detectar la respuesta de IgM. En los casos en que no se obtiene un perfil típico son de gran utilidad las pruebas que permiten la caracterización de la avidez de IgG específica.

En los últimos años se han desarrollado métodos para IgG e IgM anti-VCA y para IgG anti-EBNA, basados en el uso de proteínas recombinantes. Cuando se han comparado la IFI convencional y las técnicas que emplean proteínas recombinantes para la detección de IgM anti-VCA se obtiene algún resultado discrepante debido a que las líneas celulares empleadas en IFI expresan no sólo VCA sino algunos otros antígenos frente a los que también se produce respuesta IgM. El ensayo de fluorescencia para anticuerpos anti-EBNA con antígeno recombinante tiene la ventaja de emplear la técnica de IFI, de más fácil desarrollo que la de IFAC. Una alternativa novedosa es la aplicación de un ensayo de IFAC sobre una línea celular que expresa tanto EBNA como VCA y EA. El método ofrece la ventaja de permitir con una única determinación realizada en un único pocillo, establecer si se trata de una infección aguda, pasada o ausente en función del patrón de fluorescencia obtenido.

Desde hace poco tiempo se aplican métodos de ELISA para el diagnóstico de la infección por EBV. Los métodos que emplean extractos celulares de células transformadas por el virus no son de aplicación para este virus dado que son altamente inespecíficos. Alternativamente se han aplicado tanto proteínas purificadas, péptidos sintéticos y proteínas recombinantes. Se ha utilizado la gp125 purificada a partir de la línea P3HR1 con la que se ha obtenido sensibilidad del 95% y especificidad del 100%. En lo que se refiere al uso de péptidos sintéticos, se aplicó el p62, cuya secuencia corresponde a una región de EBNA1, para desarrollar un ensayo que diferenciaba respuestas IgM e IgG. El ensayo adolecía sin embargo de falta de sensibilidad cuando se comparaba con los criterios de referencia; de hecho su sensibilidad es muy similar a la de los ensayos que miden AH. Muy recientemente se dispone de ensayos que emplean péptidos sintéticos de VCA, p18 o una fracción de ella de 56 aminoacidos, que poseen las regiones inmunodominantes del antígeno de la cápside de estos ensayos se dispone sólo de información limitada pero muy satisfactoria en cuanto a la correlación clínica entre serología y pacientes. Existen ensayos de ELISA que detectan IgG frente a EBNA (empleando el recombinante p72 y p58). e IgG, IgM e IgA frente a EA, empleando recombinantes de EA (p54 y p138) con valores de sensibilidad y especificidad del 94 y 100% respectivamente que permiten el diagnóstico de la MI cuando se usan conjuntamente en forma de perfil. Por otra parte, se ha desarrollado un ELISA compacto que emplea como antígeno una mezcla de VCA, EA y EBNA, controlada con anticuerpos monoclonales dirigidos contra p58, gp125, y p72 La detección de IgM con este ensayo muestra una sensibilidad del 100% y una especificidad del 89%.

DIAGNOSTICODIFERENCIAL

La mayoría de casos de MI está producida por el EBV. Sin embargo, algunos virus y otros patógenos fundamentalmente citomegalovirus (CMV), el herpesvirus humano-6 (HHV-6), y Toxoplasma gondii) son capaces de producir un síndrome similar a mononucleosis clínicamente indistiguible de la MI. Es importante pues establecer el diagnóstico diferencial entre EBV y estos otros patógenos. Este hecho adquiere especial relevancia teniendo en cuenta dos factores. Primero, la propia patogenia de la MI, en la que se produce una estimulación de linfocitos B de memoria, que se puede manifestar en la síntesis de IgM específica frente a patógenos que han infectado previamente al paciente. Por otra parte, tanto el EBV como el CMV y el HHV-6 son herpesvirus, y muestran un cierto grado de reacción cruzada, que se puede detectar cuando se mide IgM específica. Por ésto, la confirmación serológica de la infección primaria por el EBV requiere el establecimiento de un perfil completo de anticuerpos específicos, especialmente en aquellos casos que cursan sin AH, que permita detectar la presencia de IgG e IgM anti-VCA, en ausencia de anticuerpos anti-EBNA. Teniendo en cuenta que algunos casos pueden cursar con presencia temprana de anti-EBNA o con ausencia de IgM anti-VCA, la aplicación de ensayos de avidez de IgG anti-VCA permiten confirmar la infección primaria por el virus.

Tabla 1.- Tipos de antígenos del VEB. Localización y función. (Modificado de Murray)

Antigeno Nuclear EBNA	Localizado en el núcleo de la célula infectada	Antígeno no estructural; es el primero en aparecer y se une al DNA celular. Está en todas las células transformadas.	Los anticuerpos se desarrollan tardíamente en la infección
Antígeno Temprano AT	AT-R Solo en el citoplasma. AT-D En citoplasma y núcleo.	AT-R aparece antes que AT-D. Es el primer signo de que la célula entra en estado lítico.	Anti AT-D aparece en la MI. Anti AT-R en L. de Burkitt.
Antígeno Cápside VCA	Localizado en el citoplasma celular	Es un antígeno tardío.Se detecta en las células productoras de virus.	La anti IgM es transitoria. La anti IgG es persistente
Antígeno de Membrana AM ó LPM	Se observa en las celulas transformadas y no productoras de virus

Tabla 2.- Perfil serológico de las infecciones por VEB

Estado clínico	Anti VCA-IgM	Anti VCA-IgG	Anti-EBNA	Anti AT	Comentarios
Susceptible	-	-	-	-	No existen anticuerpos
Infección Primaria	+	+ ó -	-	+ ó -	Anti EBNA es siempre negativo.
Infección crónica	-	+	-	+	En la práctica es raro
Infección pasada	-	+	+	-	Siempre EBNA positivo
Reactivación	- ó +	+	+	+
La aparición de IgM específica frente a VCA no es siempre detectable. Con cierta frecuencia los anticuerpos heterófilos suelen ser negativos en los niños.

Nota: Agradecemos a Fernando de Ory su colaboración en la redacción del área del diagnóstico de la infección.

Lecturas Recomendadas

Sumaya CV, Ench Y (1985) Epstein-Barr virus infectious mononucleosis in children. I. Clinical and general laboratory findings. Pediatrics 75:1003-1010.

Yamamoto M, Kimura H, Hironaka T, Hirai K, Hasegawa S, Kuzushima K, Shibata M, Morishima T (1995) Detection and quantification of virus DNA in plasma of patients with Epstein-Barr virus associated diseases. Journal of Clinical Microbiology 33:1765-1768

Linderholm M, Boman J, Juto P, Linde A (1994) Comparative evaluation of nine kits for rapid diagnosis of infectious mononucleosis and Epstein-Barr virus specific serology. Journal of Clinical Microbiology 32:259-261.

Svahn A, Magnusson M, Jägdahl L, Schloss L, Kahlmeter G, Linde A (1997) Evaluation of three commercial enzyme linked immunosorbent assays and two latex agglutination assays for diagnosis of primary Epstein-Barr virus infection. Journal of Clinical Microbiology 35:2728-2732.

de Ory F, Antonaya J, Fernández MV, Echevarría JM (1993) Application of low avidity immunoglobulin G studies to diagnosis of Epstein-Barr virus infectious mononucleosis. Journal of Clinical Microbiology 31:1669-1671.

P.Murray, W. Drew, G.Kobayashi, J.Thomsom. Microbiología Medica.(1995). Herpes Virus. 517-523.

Epstein A y Achong B.G. The Epstein-Barr Virus: Recent Advances. (1986) Heinemann edit.

Jeffrey I Cohen. Epstein-Barr Virus and the Immune System. Hide and Seek. Jama. August 13,1997. Vol