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Protocolos de Diagnóstico Serológico Clínico - Núm. 4
Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio Fuertes Ortiz de Urbina
Cortesía de Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica, S.A.
La brucelosis es una enfermedad originada, tanto en el hombre como en los animales, por microorganismos del género Brucella. Son cocobacilos Gram negativos, pequeños, aerobios (solo B.abortus y B.ovis requieren CO2) , inmóviles y de crecimiento lento. Aunque se reconocen seis especies los estudios de hibridación de DNA demuestran que se trata de una sola especie, Brucella melitensis, con biovariedades. La afinidad por el huésped y la tradición hace que continúe utilizándose la antigua nomenclatura. De las seis especies (biovariedades) solo cuatro se asocian con la enfermedad humana: B. melitensis, B. abortus, B. suis y B. canis (B. ovis y B. neotomae no producen patología en el hombre). Su capacidad patogénica depende en gran manera de su tipo de fase. B. melitensis, B. abortus y B. suis siempre se encuentran en fase lisa (presencia de lipopolisacárido) aunque la variación de fase, L a S, se produce con mucha facilidad en los aislamientos en el laboratorio.
La brucelosis es una zoonosis de distribución mundial, con reservorio en animales domésticos, que produce una enfermedad leve en su huésped: B. abortus en el ganado vacuno, B. melitensis en cabras y ovejas, B. suis en cerdos y B. canis en perros. El microorganismo tiene tropismo por los órganos con eritriol (mama, útero, placenta y epidídimo) pudiendo producir esterilidad, aborto o estados de portador. El paso al hombre se produce por contacto directo o indirecto con el reservorio siendo enfermedad frecuente en veterinarios, trabajadores de mataderos o granjeros. También en consumidores de leche fresca y derivados así como personal del laboratorio. La entrada en el organismo puede realizarse por vía digestiva al ingerir productos contaminados pero existen otras vías para el contagio (genital, nasofaríngea y conjuntival) que igualmente son muy eficaces. La transmisión hombre-hombre es prácticamente inexistente.
La estructura antigénica más importante es el Lipopolisacárido (LPS) el cual es el responsable de las reacciones cruzadas entre las biovariedades lisas y con algunos gramnegativos. Presenta dos antígenos (A y M) en diferentes cantidades según la especie y en la membrana externa posee proteínas parecidas a la OmpA y OmpF del E. coli.
Una vez que la bacteria penetra en los linfáticos y se multiplica, pasa a la sangre localizándose principalmente en órganos y tejidos ricos en células retículo endoteliales (SER) como son el hígado, bazo, linfáticos, médula ósea y riñones. El suero es capaz de opsonizarla preparándola para ser fagocitada por los polinucleares.B. melitensis es más resistente a este proceso. Por mecanismos pobremente entendidos, la brucela es capaz de sobrevivir e incluso multiplicarse en el interior de los fagocitos (polinucleares y macrófagos del SER) por lo que este acontecimiento no termina con la bacteria y condiciona además la biología de la enfermedad y el tipo de tratamiento.
El factor más importante de virulencia de este microorganismo es el LPS que tienen las formas lisas. Las que se encuentran en la fase rugosa en general son menos virulentas para el hombre por lo que su tratamiento es menos problemático. El control de la infección recae fundamentalmente sobre los linfocitos T que de forma secuencial activan a los macrófagos y desencadenan una hipersensibilidad retardada frente a los antígenos proteicos. Este fenómeno puede ser el responsable de la formación de granulomas en un intento de evitar la diseminación de la infección.
Los síntomas clínicos no son característicos y cualquier manifestación es posible. Las complicaciones esqueléticas, gastrointestinales, cardiovasculares, pulmonares, neurológicas y cutáneas son frecuentes.
La prevención puede conseguirse erradicando la enfermedad en los animales domésticos mediante la vacunación y pasteurización de la leche. En la vacuna animal se han empleado las cepas B. abortus 19 y B. melitensis Rev-1. Para la prevención en los individuos pertenecientes a grupos de riesgo se emplearon vacunas vivas atenuadas pero en la actualidad no se utilizan.
El diagnóstico de la brucelosis se basa en la sospecha clínica de la enfermedad, pero es necesario tener la confirmación en el laboratorio, bien demostrando las brucelas en cultivos o bien estudiando los anticuerpos. El problema de los cultivos es su lentitud para crecer ya que en ocasiones Brucella tarda en recuperarse más de 15-30 días.
Puesto que los síntomas clínicos son inespecíficos en la mayoría de los casos, la historia epidemiológica es muy importante a la hora de establecer el diagnóstico. La analítica suele ser bastante inespecífica, por lo que el diagnóstico se basa en el aislamiento de la bacteria a partir de sangre, médula etc. Unicamente un 20-30% de los diagnósticos de enfermedad brucelar se acompañan de este aislamiento; así pues la demostración de anticuerpos anti-Brucella se convierte en la forma alternativa y rápida de diagnóstico. El problema diagnóstico de esta infección radica en la dificultad existente para la clasificación de las recaídas, las reinfecciones y las formas subclínicas lo cual supone un serio contratiempo a la hora de establecer una pauta para el tratamiento.
Las pruebas serológicas para el diagnóstico de esta infección exploran la presencia de anticuerpos dirigidos fundamentalmente contra el antígeno somático O lipopolisacárido (LPS , antígenos A y M) o las proteínas del microorganismo. En el momento actual el diagnóstico indirecto se basa en las pruebas de:
Rosa de Bengala.
Seroaglutinación en tubo, placa de microtitulación o porta.
Coombs anti-Brucella o su modificación Brucellacapt7 .
ELISA para IgM, IgG e IgA específica..
También existen intentos para utilizar la PCR en su diagnóstico. La fijación de complemento se utiliza ya muy poco al igual que otras pruebas que empleaban sulfitorreductores ( 2-ME o DTT) y que comentaremos más adelante. La interpretación de los resultados obtenidos con estas pruebas, ya sea en una sola muestra o mejor en muestras seriadas, pueden aclarar en muchos casos si nos encontramos con una primoinfección, una recaída o una reinfección, dato muy importante para el pronóstico del paciente tal y como se comentó anteriormente.
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Rosa de Bengala
Es una prueba muy útil y rápida que fue recomendada en su día por el Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en brucelosis. Detecta fundamentalmente anticuerpos para el LPS (A+M). Consiste en una aglutinación en porta con brucelas suspendidas en tampón lactato (muy ácido) coloreado con Rosa de Bengala. Tiene un valor predictivo muy alto y tiene la ventaja de realizarse con el suero sin diluir. Es positiva en el 99% de los enfermos que padecen brucelosis o que han tenido contacto previo con el agente. Es una prueba que presenta escasísimos fenómenos de prozona por lo que su negatividad descarta prácticamente la enfermedad brucelar y su positividad, en presencia de síntomas, confirma la infección. Detecta el mismo tipo de anticuerpos que la seroaglutinación por lo que la correlación entre ellas es muy buena. Puede realizarse con diluciones seriadas del suero y obtener así un resultado cuantitativo en forma de título, pero desde el punto de vista económico este procedimiento es más caro que la aglutinación en tubo.
Algunas muestras que tienen anticoagulantes pueden producir con este test fenómenos de floculación simulando resultados positivos. En manos experimentadas estos fenómenos son fácilmente distinguibles mediante la observación con lupa del sobrenadante que adquiere un aspecto lechoso muy diferente de lo que ocurre con el control positivo.
2 Seroaglutinación
Desde hace mucho tiempo es la prueba mas utilizada. Es sencilla, sensible y específica. Puede realizarse en tubo o en placa de microtitulación y al igual que Rosa de Bengala detecta anticuerpos para el LPS. Mide globalmente anti- IgG e IgM.
Se realiza enfrentando diferentes diluciones del suero problema con una suspensión de brucelas formolizadas a una concentración preestablecida y estandarizada. El antígeno empleado es Brucella abortus 1119-3 en fase lisa (United States Department of Agriculture, National Veterinary Laboratory. Iowa) o cepa 99 (WHO/FAO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis. United Kingdom). Este antígeno es también reactivo para los anticuerpos generados por B. melitensis y B. suis (Todas ellas presentan fase lisa y por tanto LPS). Para el diagnóstico de B. canis y de B. ovis es necesario la preparación de antígeno específico ya que al ser especies de fase rugosa carecen de LPS-O. Algunos autores han recomendado el lavado previo de la suspensión para eliminar el antígeno soluble que pueda estar en la fase líquida y que pueden debilitar la aglutinación. Con este proceder los títulos obtenidos suelen ser más elevados que cuando se utiliza la suspensión antigénica sin lavar, especialmente si es antigua. Puede igualmente realizarse en tubo o placa de microaglutinación. Existe un suero control valorado para la expresión de los resultados cuantificados en UI/mL pero, en general, estos se expresan en título de dilución del suero. Como punto final de la reacción puede escogerse el último tubo o pocillo con aglutinación visible (sobrenadante claro) o el siguiente a este ( 50% de aglutinación). Por ello puede darse alguna variación en el título dependiendo de la costumbre empleada para la lectura. Es no obstante un método muy reproducible siempre que se emplee la misma marca de antígeno. No es infrecuente la presencia del fenómeno de prozona y por tanto la aglutinación deberá realizarse siempre sobre una dilución seriada de la muestra. Para evitar un resultado falso negativo el rango de la dilución del suero deberá alcanzar, al menos, el título de 1/320. Es muy raro que los falsos negativos sean producidos por la presencia exclusiva en el suero de anticuerpos incompletos los cuales pueden ponerse de manifiesto mediante otras técnicas.
La actividad aglutinante de un suero esta ligada a inmunoglobulinas de las clases IgM, IgG e IgA, especialmente a IgM. Los anticuerpos aglutinantes hacen su aparición muy pronto y alcanzan su título más elevado rápidamente. En la enfermedad aguda son ya frecuentes títulos muy superiores a 1/160 - 1/320 (100-200 UI/mL), casi siempre superiores a 1/512 en la primera muestra, pudiéndose demostrar una disminución significativa de los mismos entre el 4º, 5º mes después de la fase inicial de la enfermedad con persistencia muy prolongada de los mismos. Es excepcional objetivar una seroconversión en el inicio de la enfermedad.
En el curso de la evolución, y tras un tratamiento eficaz, los títulos tienden a negativizarse en el plazo de un año; sin embargo, pueden persistir títulos positivos a niveles más bajos durante más tiempo. Estas cifras residuales, en ausencia de síntomas, no justifican nuevos tratamientos.
Requiere atención especial, con vistas a orientar el tratamiento, el diagnóstico de las formas crónicas de la enfermedad y la diferenciación entre la recaída o reactivación y la reinfección. En todas estas situaciones los títulos obtenidos mediante la seroaglutinación suelen ser moderados no superando, en general, 1/320-640. En estos casos se hace necesario el empleo de otros test adicionales para poder establecer el estadio con ciertas garantías.(Coombs o estudio de clase de inmunoglobulinas IgG e IgM).
Títulos débilmente positivos (< 1/80) no permiten el diagnóstico de enfermedad activa ya que pueden ser consecuencia de un simple contacto con el microorganismo o sensibilización. Muchos individuos que viven en zonas endémicas o que practican profesiones relacionadas con cierto tipo de ganado presentan estos títulos. Algunas personas que poseen anticuerpos frente a Vibrio cholerae (vacunadas), Campylobacter fetus, Francisella tularensis, algunos serotipos de E. coli y Salmonella pueden dar falsos positivos. Es clásica la reactividad cruzada con Yersinia enterocolitica tipo 9 dada la similitud de su LPS. (complejo antigénico A y M).
3 Test de Coombs anti-Brucella
En algunos pacientes, principalmente en aquellos en los que se cronifica la enfermedad, se producen además otro tipo de anticuerpos de clase IgG caracterizados por la ausencia de poder aglutinante. Para detectar estos anticuerpos se aplica la técnica de Coombs al test de la aglutinación en tubo o en microplaca. La prueba es muy laboriosa ya que requiere centrifugación y lavados sucesivos de los tubos negativos de la aglutinación, adición posterior de globulina anti-humana, incubación y lectura. Un título de Coombs se considera positivo solamente cuando su valor supera al obtenido con la aglutinación al menos en dos diluciones. Esto quiere decir que un suero con título de aglutinación 1/640 y prueba de Coombs de 1/1280 es Coombs negativo y con título superior a 1/2560 positivo. Nunca la prueba de Coombs puede ser de inferior título al obtenido con la aglutinación ya que por definición con aquella también medimos anticuerpos aglutinantes. Si esto ocurre se deberán repetir ambas.
Como hemos citado anteriormente la producción de anticuerpos no aglutinantes es más frecuente en las formas evolucionadas no curadas de brucelosis por lo que la positividad evidente del test será indicio de esta forma clínica de enfermedad. En general, en las fases crónicas o en las recaídas de la infección los títulos del Coombs anti-Brucella son muy elevados, y superan con mucho a los obtenidos mediante la aglutinación.
Tomado independientemente y dada su gran sensibilidad este test podría ser considerado como el mejor de todos para despistaje de brucelosis, puesto que tiene la posibilidad de detectar todos los tipos de anticuerpos anti- Brucella. Desgraciadamente su complejidad no hace viable su utilización en este sentido.
Recientemente se puede obtener en el mercado un nuevo reactivo (Brucellacapt7.Vircell) para el diagnóstico de la brucelosis. Su diseño permite la detección simultánea de los anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes con lo que se obtiene una alta sensibilidad para el diagnóstico. Es una prueba de inmunocaptura-aglutinación para la detección de anticuerpos totales que se realiza de forma simple y cómoda. La prueba consta de tiras de pocillos de fondo en U tapizados con inmunoglobulina antihumana. Tras la adición de los sueros y su dilución seriada con micropipeta se añade el antígeno (brucella coloreada, muerta por calor y tratamiento posterior con formaldehido al 0,5%) y se incuba hasta que se produce la aglutinación. Esta se hace visible por la formación de una monocapa de antígeno recubriendo el pocillo. Con este procedimiento se ha obtenido una elevada correlación con la prueba clásica de Coombs con la ventaja de que su realización es mucho menos laboriosa y no necesita de elementos auxiliares. Probablemente este procedimiento sustituya al clásico Coombs anti-brucella y pueda ser empleado en cualquier tipo de laboratorio.
4 Fijación
de complemento
Es una técnica menos utilizada debido a su complejidad técnica. No obstante es una prueba muy específica. La capacidad de Fijación del Complemento se detecta más tardíamente que la aglutinante pero persiste durante largo tiempo (12-13 meses). En la brucelosis aguda los títulos obtenidos por Fijación de Complemento son similares o ligeramente inferiores a los de seroaglutinación. En los casos de evolución crónica los resultados son semejantes a los obtenidos con la prueba de Coombs. No añade información adicional útil a las anteriormente comentadas.
5 Pruebas
enzimáticas (E.L.I.S.A.)
Desde hace algún tiempo están apareciendo diferentes trabajos y publicaciones sobre la aplicación de los test enzimáticos al diagnóstico serológico de la brucelosis. En casi todos ellos el antígeno ligado a la fase sólida es el lipopolisacárido de la pared bacteriana (Brucella abortus 99) más o menos purificado. En ocasiones se ha utilizado el microorganismo entero y en otros proteínas de membrana. Del análisis de la literatura está claro que estos test pueden detectar inmunoglobulinas específicas con sensibilidades que oscilan entre el 93 y 97% con una especificidad del 98%. Esta sensibilidad parece aumentar si el antígeno empleado es de naturaleza proteica. La aplicación experimental de estas pruebas evidenció la posibilidad de diagnosticar infecciones brucelares en estadíos muy tempranos en los que la serología convencional aún no era positiva e incluso en algunos casos, confirmados por aislamiento del microorganismo, en los que nunca fue positiva. La valoración de los resultados obtenidos con ELISA debe de ser individualizada esto es, comparando las concentraciones de las diferentes clases de anticuerpos a lo largo de la enfermedad medidas contra un cut-off que deberá establecerse.
La principal aportación de ellas es la posibilidad de medir por separado las diferentes clases de inmunoglobulina IgM, IgG, e IgA específica. Los trabajos más interesantes son aquellos que tratan de correlacionar estos niveles con los resultados de las pruebas clásicas y con la situación clínica del paciente. En este sentido, se ha obtenido una buena correlación entre los niveles de IgM y los títulos de seroaglutinación así como los de IgG con la prueba Coombs y la Fijación de Complemento. Esto indica que las concentraciones de IgM están más elevadas en la fase aguda de la enfermedad que en las recaídas y fases crónicas en las que el predominio de anticuerpos se debe a la IgG.
Desde el punto de vista cinético está suficientemente demostrado que durante la fase aguda existe una respuesta de anticuerpos clásica: aumento de IgM e IgG y que a lo largo de la evolución el título de IgM va descendiendo. Aunque algunos autores postulaban lo contrario los anticuerpos de clase IgM no vuelven a elevarse de forma significativa en los casos de una nueva recaída o de reinfección. La IgM puede detectarse con títulos decrecientes durante unos 8-10 meses. En los casos que evolucionan a la curación, la IgG específica puede ser detectada con títulos progresivamente decrecientes aproximadamente unos 30 meses y sólo se mantienen estables y elevados o aumentan en los casos de reinfección o recaída. ELISA IgA alcanza igualmente valores elevados en todas las formas de enfermedad y ocupa una posición intermedia entre ambas con persistencias medias de 18 meses. Al igual que ELISA IgG se eleva en las recaídas y reinfecciones . El problema de la utilización de estas pruebas surge de la poca experiencia clínica que existe para correlacionar los resultados con la evolución clínica. Pocos autores se han planteado la realización de ELISA total (IgG+IgM+IgA) como prueba diagnóstica única de gran sensibilidad para la búsqueda de anticuerpos. En este sentido parece que en el 99% de los pacientes con aislamiento positivo de brucella tienen esta prueba positiva a pesar de poder ser negativos alguno de los test clásicos.
La medida de la avidez de los anticuerpos por su antígeno también puede cuantificarse fácilmente con la metodología ELISA. Existen algunos trabajos que demuestran con esta técnica baja avidez en el 70% de los pacientes con fase aguda y alta avidez en el resto de las formas clínicas.
La aplicación de ELISA en la infección del SNC ha abierto los horizontes de su diagnóstico. El 99% de los LCR testados en estos casos son positivos para IgG y aproximadamente un 70-80% lo son también para IgM e IgA. Es una prueba muy específica de tal manera que su negatividad descarta prácticamente la neurobrucelosis. En esta forma clínica sólo la positividad de las pruebas clásicas ( Rosa de bengala, aglutinación y coombs) puede confirmar la afectación del SNC pero existen falsos negativos por falta de sensibilidad.
Diagnóstico mediante
PCR
La microbiología molecular también ha entrado en el diagnóstico de esta infección. La literatura referente a PCR y brucella de los dos últimos años presenta abundantes trabajos y ensayos. La característica común de todos ellos es la sensibilidad que muestran para la detección de brucella en diferentes muestras (sangre, médula, leche, orina etc.). Igualmente los protocolos de extracción y las regiones dianas a amplificar son tan variadas que es difícil decidir cual de ellas será la adecuada. PCR es empleada también para la determinación de la especie infectante y estudios epidemiológicos. No cabe duda que en un próximo futuro, dada la dificultad y tiempo empleado en el aislamiento, la PCR tomará un evidente protagonismo en los laboratorios clínicos.
Existen otros test serológicos basados en diferentes principios como la Inmunofluorescencia (IFI), el empleo de sulfito reductores tales como el 2-mercaptoetanol o ditiotritol, test de bloqueo etc. que tuvieron predicamento en otra época pero pensamos que actualmente han sido superados por lo que solamente son citados a título informativo.
Es fácil prever que, a pesar de la gran variedad de pruebas serológicas disponibles en el momento actual para el diagnóstico de la brucelosis, en el futuro sólo se emplearán la prueba de Rosa de bengala, Coombs y las pruebas ELISA para determinar los anticuerpos totales y las diferentes clases de inmunoglobulinas. PCR tomará el protagonismo para el diagnóstico rápido dejando el aislamiento para trabajos más especializados. Con ello se acortará el tiempo necesario para el diagnóstico aportando además información útil para definir el estadío evolutivo o forma clínica de la enfermedad y el tipo de tratamiento más adecuado para cada uno de ellos.
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