DSC

Protocolos de Diagnóstico Serológico Clínico - Núm. 1

Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio Fuertes Ortiz de Urbina

Cortesía de Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica, S.A.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE
LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS:
EL DIAGNOSTICO INDIRECTO

Versión 1.1; Julio 1996

Introducción

El organismo dispone de un sistema de defensa inespecífico que le permite defenderse de los patógenos externos en ausencia de un contacto previo con ellos (en ausencia de reconocimiento), y de un sistema de defensa específico, más desarrollado y sofisticado, que le permite defenderse con eficacia frente a los microorganismos y que exige para su desarrollo de un reconocimiento previo del agente. Este segundo mecanismo de defensa puede adquirirse por contacto con el agente o sus antígenos a través de una infección, por inoculación voluntaria (vacunación) o por administración de anticuerpos preformados en otro organismo (anticuerpos maternos transferidos a través de la placenta o por administración de sueros hiperinmunes). Esta respuesta es específica y con capacidad de distinguir entre lo propio y extraño; en las ocasiones en las que existe conflicto en este reconocimiento aparece la enfermedad autoinmune. La respuesta es mas o menos persistente y capaz, además, de dejar recuerdo de este su primer contacto con el ant¡geno (memoria inmunológica) que le permitirá reaccionar de forma más eficaz y violenta en las exposiciones posteriores al mismo antígeno.

El hecho de que el organismo disponga de una respuesta inmune específica no solo capacitará para defenderse de esos agentes sino que nos permitirá conocer en muchos casos la presencia de una enfermedad infecciosa; esta es la base del diagnóstico microbiológico indirecto. La denominación de indirecto se refiere a que el diagnóstico no se hace por aislamiento e identificación del microorganismo causante de la infección, sino a través de la respuesta del huésped, es decir, de forma indirecta.

Bases del diagnóstico indirecto

Para comprender mejor las bases del diagnóstico indirecto conviene recordar las bases fundamentales de la respuesta inmune: Distinción entre propio y extraño, especificidad y memoria. Mientras que la primera hace mención a que el sistema inmune no debiera responder en condiciones normales frente a sus propias sustancias, las otras dos propiedades son de la mayor importancia para comprender el diagnóstico indirecto.

La especificidad es la propiedad que permite al sistema inmune responder frente al agente externo que la provocó y que esa respuesta no afecte a otros antígenos, incluso a aquellos que pudiesen tener un parecido molecular (reacción cruzada). Cuanto más específica y afin sea esa respuesta más efectiva será su unión al agente provocador. La persistencia de esos anticuerpos varia en el tiempo y ello depende de muchos factores: Estímulo inicial, reinfecciones subclínicas repetidas etc.; por ello encontrar anticuerpos frente a un determinado antígeno nos harásuponer de forma indirecta que el organismo tiene o ha tenido contacto con él o con antígenos de su procedencia.

La memoria inmunológica permite que el sistema inmune recuerde haber tenido contacto previo con un antígeno y responda frente a él de forma anamnésica. Esta respuesta será más rápida y violenta, uniéndose al organismo una gran concentración de anticuerpos en muy poco tiempo. Esta propiedad es la base fundamental de la eficacia de las vacunas.

La memoria inmunológica supone, sin embargo, un serio inconveniente a la hora de utilizar la respuesta inmune para el diagnóstico indirecto de una infección. En efecto, el mantenimiento de una cierta concentración de anticuerpos durante largo tiempo nos dificulta, con algunas técnicas, conocer si esos anticuerpos específicos que encontramos en el suero del enfermo han sido provocados por una infección actual y/o reciente, o son restos persistentes de una infección antigua y curada. Actualmente se disponen de mecanismos para poder discriminar entre estas dos tipos de situaciones, como veremos a continuación.

La respuesta inmune y el diagnóstico serológico

Cuando un individuo se pone en contacto con un antígeno por primera vez ocurren los siguientes fenómenos que se relacionan con el diagnóstico serológico.

1. Aparición precoz de anticuerpo específico de clase IgM . La concentración de este anticuerpo no es muy alta y su persistencia es generalmente corta. Su detección se identifica habitualmente con infección aguda, aunque en algunas infecciones se correlaciona no solo con la fase temprana de la enfermedad sino también con la actividad de la misma en estadíos crónicos (Hepatitis B, delta). Este marcador no es siempre detectable en la fase aguda de la infección.

2. Aparición algo más tardía de anticuerpo específico de clase IgG. La concentración de este anticuerpo va creciendo hasta alcanzar, en 3-6 semanas, una meseta que muy lentamente desciende. Su persistencia suele ser muy prolongada, mucho mas allá de la curación del enfermo y en ocasiones es detectable durante toda la vida. Este hecho de mantenerse positiva después de la curación limita su interpretación cuando se detecta aisladamente. Estos dos datos relativos a la respuesta inmune nos permiten un uso más apropiado para el diagnóstico. Efectivamente, la detección de IgM específica a unas concentraciones determinadas y dada la brevedad de su duración nos faculta para realizar un probable diagnóstico de la infección aguda. Por otra parte, la observación de un incremento en la concentración de IgG específica en dos muestras separadas en el tiempo - una en fase aguda y otra convaleciente (habitualmente dos semanas) - nos indica la presencia de un estímulo antigénico en ese momento, o lo que es lo mismo, la existencia de una infección aguda. Este incremento en la concentración de anticuerpos específicos cuando comparamos dos muestras de suero en un paciente recibe el nombre de seroconversión, y para buscarla, el estudio se realizar&aacte; con dos muestras de suero del mismo enfermo con objeto de comprobar el aumento de la concentración de anticuerpos.

Necesidad del diagnóstico indirecto

Existen situaciones en las que el diagnóstico indirecto se hace indispensable. Estas son: 1) Los cultivos, en ocasiones, pueden ser negativos si las muestras se obtienen después del tratamiento o porque el virus no es cultivable. 2) El aislamiento del patógeno puede ser imposible si la muestra se tomótarde cuando el agente ya no se elimina. 3) En algunas fases subagudas de la enfermedad los microorganismos son difícilmente recuperables. 4) La interpretación de un aislamiento puede ser conflictiva cuando existe el estado de portador sano que puede eliminarlo durante bastante tiempo después de la fase aguda. 5) En casos atípicos o asintomáticos y 6) En los aislamientos mixtos en los que es difícil predecir cuál es el agente etiológico causal.

Utilidad de los estudios serológicos

Los estudios serológicos pueden emplearse fundamentalmente para:

1.- Estudios de diagnóstico

Aunque el diagnóstico directo tiene muchas ventajas, existen situaciones en las cuales éste no es posible o es muy caro. En general se trata de infecciones víricas de aislamiento difícil o no víricas pero de patógeno difícilmente cultivable o no cultivable. En estos casos, el diagnóstico indirecto puede darnos a conocer la etiología de la infección.

2.- Estudios epidemiológicos

La demostración del estado inmunitario de una población con respecto a uno o varios patógenos puede hacerse fácilmente mediante este tipo de diagnóstico. El estudio retrospectivo de los anticuerpos presentes nos indicará la prevalencia de este microorganismo/s en dicha población y dependiendo de su distribución etaria la conveniencia o no de establecer campañas de vacunación.

Elección de una prueba serológica. Sensibilidad, especificidad

La incorporación de una técnica nueva a un laboratorio clínico debe de estar precedida de estudios de evaluación. Una prueba serológica se evalúa, fundamentalmente, por los parámetros de sensibilidad , especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres valores intrínsecos de la misma se deducirá su aplicación o no en determinadas circunstancias y como deberá interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo.

La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que están en la situación que queremos diagnosticar. Cuantos más resultados positivos produzca en este grupo de enfermos mas sensibilidad tendrála prueba y menos resultados falsos negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en individuos con esa enfermedad y esa técnica. En serología es difícil tener pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algún resultado negativo falso.

La especificidad se mide,por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se define como el porcentaje de verdaderos negativos que serán detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas con especificidades casi del 100%. Estos dos parámetros son propiedades intrínsecas del test y no varían nunca con relación a la población estudiada.

Valor predictivo

La utilidad de una prueba es la resultante de los valores predictivos (VP), positivo (VPP) o negativo (VPN), obtenidos al emplearla sobre una población general en la que existen individuos sanos e infectados por el agente frente al que queremos investigar los anticuerpos. Conocer estos valores es muy importante ya que ellos serán los que nos indiquen la conveniencia de emplearlo para confirmar una enfermedad o para descartarla. El VPP de un prueba es el porcentaje de resultados verdaderamente positivos (VP) obtenidos con ella cuando la aplicamos a una población general. Igualmente el VPN es el porcentaje de pruebas verdaderamente negativas (VN) aplicadas a la misma población. VPP y VPN se calculan mediante las siguientes relaciones:

VPP = (VP/(VP+FP))x100 y VPN=(VN/(VN+FN))x100

El VPP y VPN se encuentran enormemente influidos por la prevalencia de la patología que queramos estudiar de tal manera que en ocasiones y tendrá un mayor valor predictivo el resultado negativo que el positivo. (Una prueba de rosa de bengala negativa, con cualquier prevalencia, descarta casi con seguridad la infección por Brucella mientras que un resultado positivo no asegura de la enfermedad y menos en una zona endémica con elevada prevalencia). Así pues el empleo de una prueba de sensibilidad alta en una población determinada nos asegura que casi todos los pacientes con anticuerpos específicos, se clasificarán como positivos pero no nos asegura que todos ellos sean VP; su VPP está influido por la prevalencia. En la tabla 1 se exponen los VPP y VPN de una prueba serológica con una sensibilidad y especificidad del 98 % en relación con la prevalencia de la enfermedad por 100.000 habitantes. En estas condiciones sólo con prevalencias superiores a un 10 % obtenemos VPP significativos.

Esto supone que el resultado de una misma prueba serológica pueda tener diferente valor predictivo: Si empleamos una prueba para rastreo del virus de hepatitis B con una sensibilidad y especificidad del 99% en un banco de sangre (prevalencia en donantes de 0,8 %) el VPP será de 47 %. Esa misma prueba empleada en una población de pacientes con síntomas compatibles de enfermedad (Laboratorio de microbiología, con prevalencias de 10%) presenta un VPP de 91%. El empleo de técnicas con elevada especificidad nos garantizará que las muestras positivas lo son de verdad pero no que todas las negativas lo sean. Al igual que en el caso anterior el VPP y VPN se ven muy influidos por la prevalencia.

Valores predictivos positivo y negativo de una prueba con 98 % de sensibilidad y 98 % de especificidad según la prevalencia

Técnicas rápidas y automatización

El laboratorio de serología, encuadrado en el Servicio de Microbiología Clínica, es el encargado de realizar el diagnóstico indirecto a través de una tecnología que ha evolucionado en el estudio y diagnóstico de las enfermedades infecciosas muy rápidamente; la aparición de los anticuerpos monoclonales fue el eje sobre el que este cambio comenzó a producirse. La producción controlada de anticuerpos más específicos y de mayor afinidad hicieron posible, por una parte la mejoría de las técnicas ya existentes (IFI, Latex, Hemaglutinación etc) y por otra la aparición de microtécnicas, (RIA, ELISA, etc.), que utilizan pequeños volúmenes de muestra para su realización. La unidad de volumen pasóde ser el mililitro (ml) al microlitro (µl), La disminución de los tamaños de todos los utensilios de trabajo del laboratorio, ( pipetas, baños, aparición de placas de microtécnica, etc, etc.) ha precipitado igualmente un cambio radical en las formas de trabajar en los mismos de tal manera que las técnicas de realización manual han sido sustituidas, en su mayoría, por aparatos automáticos que permiten en priemr lugar el manejo de gran cantidad de muestras y en segundo lugar la realización simultánea de gran número de pruebas y técnicas quedando los procedimientos manuales relegados para realizar o pruebas individualizadas muy rápidas o aquellas de las que existe poca demanda.

Desde siempre el inconveniente más importante que ha tenido el diagnóstico indirecto ha sido su falta de rapidez. Al tiempo que tarda el organismo en formar los anticuerpos se le sumaba la tediosidad en tiempo de la realización técnica. La llegada de la biología molecular ha puesto a nuestra disposición la posibilidad de producir antígenos nativos lo que ha permitido una gran expansión del catálogo de pruebas diagnósticas disponibles en los últimos años y por otro se ha mejorado mucho las pruebas permitiendo acortar sustancialmente los tiempos de realización de las mismas. En la actualidad es muy rara la metodología que no pueda realizarse a lo largo de unas pocas horas o incluso minutos y todas ellas con una calidad excelente. Todas pueden por tanto considerarse como técnicas cortas y aunque es muy difícil de precisar en cuánto disminuye el coste de la enfermedad la celeridad y el significado diagnóstico de un resultado serológico, sí es cierto que en muchas ocasiones elimina la práctica de otras exploraciones complementarias y la aplicación más dirigida de los tratamientos. Esto hace del mismo un método nada despreciable,y a veces único, a la hora de plantearse en clínica el diagnóstico etiológico de algunas enfermedades infecciosas.

Los laboratorios actuales orientan las técnicas manuales a la realización de pruebas con poca demanda y por tanto no rentables para la automatización o aquellas que son de muy corta realización. Entre estas encontramos las comúnmente conocidas como pruebas de Látex, aglutinación en tubo o porta, inmunofluorescencia y algunas pruebas enzimáticas con soporte de micropartículas en las que el resultado de la reacción adopta formas significativas cuando la reacción es positiva.En general estas pruebas tienen una sensibilidad excelente cuando las comparamos con las de referencia lo que ha permitido incorporarlas a las pequeñas unidades de Diagnóstico Rápido de los Servicios de Microbiología. Las pruebas que pueden automatizarse se realizan mediante máquinas robots. El ideal de estas máquinas es el evitar cualquier trabajo manual, ganar en seguridad y disminuir la penosidad en el trabajo. La seguridad se obtiene al evitar en lo posible los errores humanos ya que por lo general estas máquinas identifican las muestras mediante códigos de barras, la diluyen si es necesario, la dispensan y realizan la incubación y lectura con interpretación de los resultados si han sido programadas por el facultativo. Pueden trabajar con un número ilimitado de sueros si el diseño es de carga continua. La mayoría de ellas están programadas para realizar simultáneamente diferentes determinaciones a una sola muestra. Esta capacidad multiparamétrica capacita a los laboratorios para la realización diaria de una gran cantidad de determinaciones en corto intervalo de tiempo, con el inconveniente de que en muchos casos las pruebas no pueden personalizarse.

Interpretación de los resultados

La expresión del resultado serológico puede ser de diferente forma dependiendo del fin para el que va a ser utilizado. Si es epidemiológico bastará, casi siempre, una expresión cualitativa indicando si existen o no anticuerpos.

Métodos cuantitativos: Concepto de "título de un suero"

En muchas ocasiones interesa conocer no sólo si el paciente tiene o no anticuerpos frente a un/unos patógenos determinados sino qué concentración o tasa de ellos tiene. Esto es útil ya que para muchas infecciones es posible correlacionar la concentración con la situación clínica o decidir si aquella ha sido una respuesta eficiente como resultado de una vacunación.

Para ello, realizamos diluciones seriadas del suero que irán sucesivamente disminuyendo la concentración de anticuerpos; el título del suero será la última dilución del suero que da una reacción positiva. Según esto, un suero con un título 1/32 tendrá menos anticuerpos que un suero con un título 1/256.

Se dice que un título es significativo cuando estadísticamente esa concentración, o una superior, se asocia con el estado de enfermedad.

Este método de expresión del resultado serológico ha sido empleado durante muchos años y es el método más inteligible ya que la cifra se correlaciona rápidamente con su significado. Existe además mucha experiencia clínica acumulada y definidos bastantes títulos significativos para muchas infecciones. En nuestra opinión, y siempre que se pueda, los resultados de una prueba serológica deben ser expresados así ya que es, probablemente, la valoración mejor interpretada en la clínica.

Aún hoy se realizan pruebas cuantitativas cuyo sistema de medida es el título del suero. En general todas son técnicas que se emplean en el diagnóstico desde hace mucho tiempo y que tienen ya una solvencia clínica más que comprobada (fijación de complemento, aglutinación en tubo y porta, inmunofluorescencia, etc.). En otras ocasiones el resultado se expresa en función de una curva que se construye cada vez y que tiene unos valores conocidos por nosotros. Los resultados de cada muestra son obtenidos por comparación con los valores de la curva.

Unidades e índices

La aparición de técnicas con la ventaja de su muy alta sensibilidad (ELISA, RIA), ha introducido algún problema en la expresión y cuantificación del resultado y, por tanto, en su interpretación. La medida del resultado se realiza mediante Unidades Internacionales o Unidades Arbitrarias. Estos unidades se calculan comparando el valor obtenido con la muestra problema con la de un patrón o muestra calibradora realizadas simultáneamente. Por definición el suero calibrador marca el límite entre los valores positivos, clínicamente significativos, y los resultados negativos de tal manera que los valores superiores al calibrador se consideran positivas y las inferiores al mismo negativas.

Este sistema es criticable por varias razones: en primer lugar sólo existen definidas en la O.M.S. la unidad internacional de anticuerpos IgG para Toxoplasma y Rubeola. En segundo lugar, la muestra calibradora se define de forma estadística en el país fabricante de la prueba y los valores predeterminados pueden no ajustarse bien en la población que va a estudiarse; esto supone en algunas ocasiones un reajuste de la calibración que no siempre es posible. En tercer lugar, el valor de la muestra calibradora tiene un valor diferente dependiendo del fabricante. Estas variables hacen difícil el cambio de metodologías ya que introducen factores de confusión para el clínico al cambiar los valores significativos.

Para obviar este problema se ha propuesto expresar los resultados en forma de Indice. Se define este como la relación entre el valor de la muestra problema y el del calibrador. De esta forma toda muestra con índice superior a 1 será clasificada como positiva y si inferior como negativa. La ventaja de este método, una vez ajustado el calibrador, es que el valor significativo siempre será el superior a la unidad y tanto mas positivo cuanto más elevado sea. La utilización del índice como forma de expresión unificaría los resultados haciendo comparables las diferentes marcas entre sí.

Sea cual sea el método seleccionado por el laboratorio para la expresión de los resultados nunca deberemos perder el concepto de que el diagnóstico indirecto de certeza se basa en la demostración de la seroconversión mediante el estudio de dos muestras seriadas (obtención de un aumento entre las dos muestras de al menos cuatro veces el título de anticuerpos o un cociente entre 1,4 y 2 si se trata de unidades o índices). Otro método que avala la infección aguda es la demostración de IgM específica siempre que estédemostrada la ausencia de persistencia de este marcador y la carencia de reacciones cruzadas.

Como norma general los anticuerpos de clase IgM se miden actualmente mediante técnicas de E.L.I.S.A. o técnicas de alguna manera relacionadas con la Inmunofluorescencia. Los anticuerpos de clase IgG se miden mediante E.L.I.S.A e igualmente por inmunofluorescencia. Cuando se trata de medir anticuerpos totales en general se realiza mediante técnicas de aglutinación (en porta, tubo o placas de microtitulación) o mediante la Fijación del Complemento

Perfiles serológicos

En la práctica diaria el diagnóstico indirecto se ha decantado, en los últimos años, por el estudio de las muestras mediante perfiles serológicos. La lógica de estas agrupaciones, similar a lo que realiza en el diagnóstico directo, descansa en que generalmente el problema clínico requiere investigar varios patógenos como posibles agentes etiológicos, como responsables de la patología del paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno a uno o simultáneamente. Obviamente la primera fórmula es más lenta y, probablemente, más económica. La segunda es lo contrario y probablemente más eficaz desde el punto de vista clínico. En ocasiones el perfil se divide en dos o tres niveles que se ejecutan progresivamente según los resultados obtenidos en el nivel anterior. Este método de perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos antígenos y la automatización ha impulsado su utilización y a nosotros nos parece un sistema bueno y eficaz para el diagnóstico dada la excelente relación entre coste, eficacia y tiempo de respuesta diagnóstica. Esta filosofía de trabajo supone una organización especial del laboratorio de tal suerte que la mayoría de las técnicas se realicen con una frecuencia mayor a la requerida si se buscan patógenos de manera independiente.

Utilización clínica de los perfiles serológicos

Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la técnica empleada (IgG, IgM o ambos) será necesario, como ya se citó en otra parte, el estudio de una o dos muestras de suero realizadas, en este último supuesto, simultáneamente. En el caso de detección de IgM una muestra extraída en la fase aguda será suficiente. En el supuesto de que midan IgG o ambas clases es mandatorio el estudio seriado.

Algunos ejemplos de la utilidad de los Periles Serológicos

Perfil respiratorio:

Este perfil está orientado al estudio de procesos respiratorios que fundamentalmente muestran patrones radiológicos poco compatibles con neumonías localizadas o lobares (bacterianas). Las más frecuentes son las producidas por los agentes en el contemplados y quizás por los de las neumonías atípicas (Mycoplasma, Coxiella, Chlamydia y Legionella).

Todos los antígenos investigados son laboriosos de diagnosticar mediante el método directo. La técnica que más se adecúa al estudio simultáneo de otros patógenos es la fijación del complemento y títulos superiores a 1/32-1/64 con una primera muestra y con clínica compatible son indicativos, en nuestro medio, de infección aguda o por Mycoplasma spp, Coxiella o Chlamydia. La fijación de complemento para investigar infecciones por Legionella spp. produce títulos bajos (1/8, 1/16) y siempre que se obtengan estos resultados la muestra deberá ser estudiada por otros métodos complementarios.

En el caso de infección aguda por paramixovirus y empleando en la reacción antígeno de grupo (nucleoproteína viral) los títulos altos de anticuerpos (>1/128) pueden ser índice de infección. Puede existir reacción cruzada entre los virus de la parainfluenza. Aunque la infección por Virus Respiratorio Sincitial puede diagnosticarse de otras maneras más eficaces el serodiagnóstico es satisfactorio en adultos y jóvenes sintomáticos. En pacientes sin síntomas y niños menores de 4 meses la tasa de seroconversiones es muy pequeña (20%).

Las infecciones por Adenovirus tienen mal diagnóstico serológico ya que la frecuencia de las infecciones repetidas y la existencia de infección crónica/persistente/latente producen altos títulos de anticuerpos residuales. La primoinfección aguda puede o no acompañarse de seroconversión por lo que el diagnóstico serológico por la técnica de fijación del complemento no es la mejor. Igualmente un resultado negativo no descarta la infección.

Para el diagnóstico de la infección aguda por Coxiella burnetti mediante fijación de complemento se emplea fundamentalmente antígeno en fase II. El 70% de los enfermos produce anticuerpos frente a este antígeno a las dos semanas del cuadro agudo incrementándose al 90% y 100% a las 3 ó 4 semanas. En los pacientes con infección crónica se detectan anticuerpos frente a fase II y fase I. También se ha ensayado, para el diagnóstico de infección crónica, la presencia de anticuerpos de la clase IgA frente a Fase I.

Mediante la fijación de complemento, utilizando antígeno de grupo obtenido en saco vitelino, puede diagnosticarse la infección por clamidias del grupo psitacosis y linfogranuloma pero no el grupo trachomatis. Con otros antígenos solubles extraídos de pared celular este último grupo puede ser diagnosticado.

Si los resultados obtenidos con este perfil mediante fijación de complemento no son significativos es mandatorio el estudio de dos muestras seriadas para objetivar la seroconversión a alguno de los antígenos estudiados. Existen otras técnicas para el diagnóstico de estos patógenos y en la actualidad comienzan a aparecer en el mercado pruebas ELISA para la determinación de IgM con lo que el diagnóstico de la infección en la fase aguda, cuando estas pruebas sean adecuadamente validadas, pronto será una realidad.

En el caso de Mycoplasma algunos autores han demostrado que la respuesta de IgM es menos frecuente en las personas adultas (20% en mayores de 20 años frente al 78% en menores de 20 años) quizás debido a que los episodios clínicos no se corresponden con primoinfecciones sino a reinfecciones. Las aglutininas al frío no son un método que hoy se emplee como forma de diagnóstico.

Perfil para el estudio de las Hepatitis Virales

Las hepatitis producidas por los virus A, B, C, Delta, y E se diagnostican casi exclusivamente mediante técnicas serológicas aunque en el caso de algunas de ellas pueda realizarse la detección de la partícula viral, sus antígenos o su DNA o RNA. Estas determinaciones, se denominan marcadores serológicos y de su estudio podemos extraer datos sobre la presencia o no de infección por alguno de ellos, la situación biológica del virus en relación con el huésped y probablemente el pronóstico de la enfermedad.

Para la hepatitis B el marcador por excelencia es el conocido como anticuerpo frente a la nucleocápside viral (anti- HBc). En nuestra experiencia, y dadas las características biológicas de este anticuerpo (véase capitulo correspondiente a las hepatitis virales) y de su cinética, su ausencia descarta que el proceso hepático sea debido a una hepatitis B y por tanto no es necesario el estudio de ningún marcador suplementario. En el caso de que su detección sea positiva deberemos realizar estudios suplementarios para la determinación de antígenos virales (Ag-HBs, Ag-HBe, DNA) para poder fijar el estado replicador del virus e infeccioso del paciente. La curación y protección se asegura por la aparición de anticuerpos frente al antígeno de envoltura (anti-HBs) siempre que su concentración supere las 10-25 UI/mL. En el caso de la vacunación éste será el único marcador positivo ya que el paciente no padeció la enfermedad y por tanto su anti-HBc seránegativo. Tras la vacunación, una vez que se han conseguido anticuerpos por encima de la tasa de protección parece que no es necesaria una nueva revacunación. Los estudios sobre la inmunidad celular en estos pacientes así lo demuestran presentando un gran estímulo clonal ante una nueva exposición.

La investigación del virus delta, en nuestro medio, casi deberá quedar restringida a los pacientes con antecedentes de adicción a drogas por vía parenteral (ADVP) siendo excepcional la coinfección o superinfección en otro tipo de enfermos.

El diagnóstico de la Hepatitis por virus C resulta más problemático debido fundamentalmente a las bajas tasas de viremia que este virus produce y al retraso en la producción de anticuerpos. Existen una serie de protocolos o algoritmos diagnósticos sobre los que no existe un consenso generalizado. Por un lado tenemos la posibilidad de detectar conjuntamente anticuerpos frente a diferentes proteínas virales (estructurales y no estructurales) mediante la técnica de ELISA Dado que los antígenos empleados en la prueba son en general de origen recombinante o sintético existe la posibilidad de obtener resultados falsamente positivos por lo que la positividad de una prueba para anticuerpos deberá ser confirmada de alguna otra forma. En general esto se realiza estudiando por separado la respuesta inmune a cada una de las proteínas o antígenos virales (RIBA, INNOLIA, MATRIX, etc.), para que la reactividad sea debida a alguno de ellos. La presencia de anticuerpos frente a este virus no presupone ni protección ni curación de la enfermedad. Curiosamente pueden coexistir anticuerpos circulantes para el virus y sus antígenos. Para la demostración de la presencia del virus se recurre a la detección de su ARN mediante técnica de amplificación genética. Recientemente se ha postulado la importancia que para el tratamiento tiene el conocer el tipo de virus infectante y la carga viral, de tal forma que midiendo estos parámetros a lo largo del tratamiento podremos evaluar la evolución de la enfermedad hepática. El virus E se diagnostica igualmente mediante la detección de anticuerpos frente al mismo.

Perfil serológico para Virus de la inmunodeficiencia adquirida

Para el diagnóstico de esta infección se emplea en primer lugar una prueba de ELISA para la detección de anticuerpos. Estas pruebas se fabrican con dos diseños: unas son indirectas y otras competitivas. Las primeras son altamente sensibles y son las empleadas rutinariamente en los bancos de sangre y en los laboratorios de diagnóstico y las segundas, menos sensibles pero muy específicas, pueden emplearse para confirmar los resultados positivos obtenidos con las primeras. Toda muestra con reactividad para estas pruebas deberá confirmarse con otra muestra de suero solicitada al paciente y si es igualmente reactiva mediante la realización de una prueba de confirmación tipo Western Blot o Innolia.

Una vez que el paciente ha sido diagnosticado la serología, durante el seguimiento clínico del paciente, se reducirá a la determinación de antígeno p24 y a los anticuerpos frente a ella (anti-p24). No existen otros marcadores útiles para este fin. Existe la creencia que hay muchas reacciones negativas para anticuerpos y que puede tratarse de pacientes en fase de seroconversión (fase de ventana). En nuestra experiencia los resultados obtenidos con las pruebas de ELISA tienen un valor predictivo muy elevado lo que hace injustificada la búsqueda de antígeno en todos los enfermos seronegativos aunque éstos tengan factores de riesgo. Pensamos que únicamente en pacientes seronegativos, con factores de riesgo y síntomas clínicos compatibles con la primoinfección la investigación del antígeno p24 puede estar justificada y obtener algún rendimiento. En los casos de accidentes con instrumentos o líquidos contaminados con estos virus creemos que la seronegatividad repetida a lo largo de 6-12 meses descarta la infección. En este momento podemos plantearnos la necesidad de investigar antígeno p24 en sangre de donante de órganos.

Perfil para gestantes e infecciones congénitas

El objetivo de este perfil no es otro que el de prevenir infecciones congénitas y como tal debe de emplearse. No se persigue con este cribaje el diagnóstico de enfermedades en la embarazada, sino la prevención de enfermedades en el feto. Existe actualmente una polémica muy intensa acerca de si este estudio se debe de realizar durante el embarazo o, de forma universal, en todas las mujeres en edad de gestar. Nuestra opinión, basada en años de experiencia, nos inclina a pensar que la realización de estas pruebas durante la gestación, especialmente el estudio de los anticuerpos frente a Toxoplasma gondii, produce muchos problemas de interpretación que pueden conducir a tomar la decisión de interrumpir el embarazo. La peculiar biología de la infección por este protozoo, su ciclo en el hombre y la escasez de síntomas clínicos que en la mayoría de los casos manifiesta, induce a confusión cuando se nos muestran sobre la mesa resultados serológicos compatibles, teóricamente, con una infección aguda. No es este el lugar de discusión sobre la forma de interpretar los resultados serológicos de cada uno de los patógenos investigados con este estudio y únicamente diremos que la detección de IgM específica frente a Toxoplasma puede prolongarse durante años después de una primoinfección. La investigación de anticuerpos frente a Citomegalovirus no está recomendada en los documentos que existen publicados sobre el particular.

La aparición del virus de la hepatitis C, su posible transmisión al feto y, sobre todo, la eliminación del virus por la leche materna, ha introducido otro asunto de discusión sobre la conveniencia de realizar este estudio al final del embarazo con objeto de aconsejar o no la lactancia materna. La situación actual del conocimiento en esta cuestión está aún confusa aunque parece que la transmisión vertical de este virus es de escaso rendimiento.

Con respecto al embarazo y VIH la opinión general, y dada la confidencialidad a la que estos estudios están sometidos, se cree aconsejable ofertar a la embarazada su determinación.y nunca realizar la prueba sin el consentimiento expreso de la paciente.

Para el diagnóstico serológico de la infección congénita se deberá tener presente la peculiaridad de su respuesta inmune según se comenta a continuación.

Consideraciones sobre el diagnóstico indirecto de la infección congénita

La respuesta inmune en el feto es algo diferente a la del adulto. Durante el primer trimestre de gestación el feto no es inmunocompetente estando imposibilitado para sintetizar sus propios anticuerpos. Durante este período la placenta, aún muy inmadura, únicamente permite el paso de un 5-10% de la concentración de anticuerpos de clase IgG que la madre posea en ese momento. La IgM nunca atraviesa la placenta. Estas circunstancias ponen al feto en una situación de indefensión frente a la llegada de cualquier agente infeccioso que sea capaz de atravesar la placenta. Durante este período, las infecciones maternas por agentes con capacidad de cruzar la placenta e infectar tejidos fetales, suelen producir lesiones en el mismo que en ocasiones son incompatibles con la vida.

Durante el segundo trimestre el sistema inmune del feto madura y éste se hace inmunocompetente. Igualmente la placenta, más madura, permite el paso de mayores cantidades de inmunoglobulinas de la clase IgG desde la madre por lo que el feto, en el caso de una infección transplacentaria, estará protegido por una doble dotación de anticuerpos específicos: los fabricados por él, ya sean de clase IgM o IgG y los transplacentarios procedentes de la madre (siempre de clase IgG); esta situación se mantiene hasta el nacimiento. A partir de este instante los anticuerpos del recién nacido (RN) que sean de origen materno se irán aclarando a razón de un 50% por mes, de tal forma que, en un período de tiempo comprendido entre los 6 y los 12 meses, los únicos anticuerpos específicos presentes en él son los de producción propia.

Conocer esta dinámica es muy importante para hacer el diagnóstico indirecto en el RN. En efecto, la presencia de anticuerpos IgM específicos en la sangre del cordón frente a un agente infeccioso es sinónimo de infección aguda congénita por el mismo, mientras que su ausencia podría descartarla. La presencia de sólo IgG específica, por sí sola, no garantiza el diagnóstico de infección aguda ya que podría tratarse de anticuerpos cedidos por la madre. Nunca una sola determinación de anticuerpos de clase IgG pueden asegurar la existencia de infección fetal.

Los anticuerpos IgM, que como se dijo no atraviesan nunca la barrera placentaria, no siempre se detectan en el suero del recién nacido como respuesta a una primoinfección. Varias son las razones para ello. En primer lugar puede ocurrir que exista un retraso en la maduración del sistema inmune fetal en el momento de la infección del feto. Como segunda causa está la presencia de anticuerpos de la clase IgG, transferidos por la madre que envuelven al patógeno y lo ocultan al sistema inmune del feto. Esta circunstancia complica el manejo de los resultados serológicos obtenidos en el RN para diagnóstico de la infección, siendo necesario en muchos casos de infección con IgM negativa el seguimiento del niño a lo largo del tiempo, generalmente un año.

Para concluir diremos que los criterios diagnósticos de infección transplacentaria en un RN son, en primer lugar la presencia de IgM específica en la sangre del cordón o en los días siguientes al nacimiento y, en segundo lugar, la persistencia o no aclaramiento de los anticuerpos IgG a lo largo de los 6-12 meses siguientes a esa fecha. Como es lógico esa espera de 6-12 meses para establecer el diagnóstico no es deseable por lo que recientemente se han descrito procedimientos para extraer sangre del cordón intraútero (funículocentesis o cordocentesis) con la que podemos realizar las determinaciones serológicas pertinentes y poder establecer así, de una manera precoz, el diagnóstico de la infección congénita.

Medida de anticuerpos en Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

Para poder asegurar mediante el diagnóstico indirecto que existe una infección del sistema nervioso central es condición indispensable que el LCR cumpla la condición de estar libre de mezcla con sangre y poder demostrar que existe producción intratecal de anticuerpos. Siempre existe un pequeño paso de anticuerpos desde la sangre al LCR, pero la concentración de anticuerpos que difunden a LCR es tan escasa que normalmente son indetectables mediante la mayoría de las técnicas. En el caso de inflamación de la barrera hematoencefálica la transferencia puede estar aumentada, haciendo detectables algunas pequeñas cantidades de anticuerpos específicos lo que hace en ocasiones difícil la interpretación de este hallazgo. Para poder asegurar la producción local de anticuerpos la titulación de los mismos se debería realizar simultáneamente en suero y L.C.R obtenido simultáneamente y comparando la relación entre la concentración de anticuerpos específicos e IgG total en sangre con la misma relación obtenida en LCR Si la relación es superior en este último suponemos que existe producción intratecal de anticuerpos. En ocasiones las concentraciones de anticuerpos en LCR son tan significativas que no es necesario este proceder (panencefalitis esclerosante por sarampión).

Consideraciones finales

Existen muchas maneras de combinar determinaciones serológicas que pueden ser realizadas simultáneamente para la búsqueda de patógenos en síndromes clínicos, perfil para agentes neurotropos, síndrome mononucleósico, perfil exantemático, para pericarditis etc, etc., y cada laboratorio podrá utilizar los que más demanda y rendimiento tengan.