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Protocolos de Diagnóstico Serológico Clínico - Núm. 5


Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio Fuertes Ortiz de Urbina

 

Cortesía de Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica, S.A.


DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 
DE LA HEPATITIS C


    En 1989 apareció el primer trabajo sobre un nuevo agente viral denominado Virus de la Hepatitis C (VHC). Del estudio comparado con otros genomas virales conocidos se dedujo su relación con la familia de los Flavivirus. La construcción de un test de diagnóstico para detectar anticuerpos frente a él ya ha clasificado la mayoría de las hepatitis postransfusionales (NANB) y otras muchas como hepatitis por Virus C (HVC).
 

Taxonomía

    Las consideraciones taxonómicas sobre el VHC se pensó que fuesen útiles no sólo para clasificar este nuevo agente dentro del reino viral sino también para ayudar al entendimiento sobre su estructura genética, mecanismos de replicación, transmisión y patogénesis. La cuestión no resultó tan sencilla. Cómo se dijo VHC está encuadrado dentro de los Flavivirus patógenos pertenecientes a un grupo de agentes llamados Arbovirus (Tabla 1). Este término, desafortunado en este momento, agrupa una variedad de virus muy diferentes cuya característica común es la de ser transmitidos mediante artrópodos pero que, paradógicamente, excluye a otros que genéticamente son muy similares y no son transmitidos por esta vía. Para el VHC no se conoce ningún artrópodo vector y sus infecciones producen enfermedad crónica y en algunos casos, los menos, una enfermedad aguda autolimitada o inaparente seguida de eliminación del virus y curación.

    El VHC no ha sido visualizado pero conocemos algo de su tamaño ya que atraviesa filtros con poros de 60 a 70 nm. Tiene aproximádamente 60 nm de diámetro con una envoltura lipoproteica en la que encontramos glicoproteinas específicas insertas en ella. La nucleocápside es de simetría icosaédrica y encierra 9400 bases alineadas en una única molécula de ARN de polaridad positiva y que circula, según estudios fisicoquímicos, como viriones intactos y nucleocápsides. Su extracción a partir de plasma infeccioso mediante disolventes lipídicos (cloroformo) inactiva el virus indicando que los lípidos son una parte esencial de su estructura presumiblemente de la envoltura. Igualmente el calor, formol y luz ultravioleta terminan con sus propiedades biológicas.

    Se ha descrito su secuencia completa la cual contiene una única zona de lectura (ORF) que codifica una poliproteina precursora de 3011 aminoácidos, que posteriormente es fragmentada en diferentes polipéptidos estructurales y funcionales. Igual que los otros flavivirus el genoma del VHC tiene en la posición 5' una región que codifica las proteínas de la partícula viral (proteínas estructurales) y otra hacia el extremo 3' que codifica proteínas enzimáticas (proteínas funcionales que no forman parte de la estructura viral NS).

REGION 5' NO CODIFICANTE

 
 
    Más allá del extremo 5' del genoma existe una pequeña secuencia de unas 34 bases que no expresa proteínas (región no codificante, 5'UTR) - Untranslated Region- y que es la zona más conservada (92, 98 % de igualdad) en todos los tipos de virus aislados (Figura 1). Esta homogeneidad de 5'-UTR hace presumir que contiene información de elementos reguladores para la traslación y también para la replicación y empaquetamiento del virus. Casi con certeza las mutaciones a este nivel son letales para el virus y no son toleradas.
 

REGION CODIFICANTE

    En esta región tenemos los genes C, E1 y E2. El gen C codifica una proteína de unos 191 aa. que forma la nucleocápside, se denomina p22 (antígeno c22). Está altamente conservada en diferentes genotipos. Los genes E1 y E2 , este último bautizado inicialmente como NS1, codifican las proteínas de la envoltura viral. E1 es el responsable de una glicoproteína de 192 aa. (antígeno gp33). E2 responde de la traslación de otra glicoproteína de 327 aa. (antígeno gp70), muy variable y que parece ser el blanco de los anticuerpos neutralizantes.

    Contiene los genes NS2, NS3, NS4 y NS5 que como se comentó codifican proteínas funcionales cada una con diferentes cometidos. VHC no produce ADNs intermediarios de la replicación ni se ha encontrado material genético integrado en el genoma del huésped desconociéndose hasta este momento el mecanismo oncogénico de este virus.

DIVERSIDAD GENETICA

    La variabilidad de los genomas ARN es consustancial con la infidelidad de copia de sus ARN polimerasas Esta diversidad en los virus ha acuñado el término de "quasiespecie" viral. La comparación entre los genomas de VHC han mostrado una considerable variabilidad en las regiones de la envoltura (E) y en las no estructurales (NS), mientras que la 5' no codificante (5'-UTR) y en mucho menor grado, la región del core están altamente conservadas. Fundamentalmente han existido dos iniciativas serias de clasificación que han sido sucesivas. Una se basaba en las descripciones de los grupos japoneses que agrupaba a los diferentes aislados en tres grupos (I,II y III) con la posibilidad de ampliación a un cuarto y otra, la más actual, se basa en las pequeñas diferencias encontradas sobre 5'-UTR, que han dado lugar a un nuevo árbol definido por Simmonds y cols en 1993 y que agrupa la mayoría de aislados conocidos. (Tabla 2)
 

ASPECTOS CLINICOS DE LA HEPATITIS C

    Como regla general la primoinfección es asintomática en el 90-95% de los casos. Las formas agudas suelen ser poco habituales (10%) y escasamente graves. El periodo de incubación se estima entre 2 y 26 semanas aunque en el 80-90% de los infectados los síntomas aparecen entre las 4 y 10 semanas; la incubación de las postransfusionales es más corto. El cuadro clínico de la forma aguda es similar al de otras hepatitis, pero el virus C no suele producir ictericia y el nivel de ALT suele ser igualmente más bajo y generalmente fluctuante, alcanzando su máximo nivel entre los 30 - 60 días postinfección y en coincidencia con la inflamación aguda del hígado. Cuadros más intensos no suelen ser habituales (5%) y dependen en gran parte de la dosis infectiva. Las formas fulminantes son muy poco frecuentes.

    Aunque la resolución definitiva de la enfermedad es posible (10 - 15 % de los casos), lo más frecuente en cualquiera de sus formas clínicas es la evolución a la cronicidad. La proporción de pacientes con infección aguda por virus C que se transforman en infecciones crónicas se estima que es un 60-70%. Si la infección ha sido adquirida por transfusión, la cronicidad es la norma en el 50-70% de los infectados mientras que en los casos esporádicos estas cifras descienden a rangos del 15- 30%.Sólo el 40-60% de los pacientes con infección crónica desarrollan hepatitis, la situación puede variar desde un estado asintomático sin daño hepático hasta una forma con hepatitis rápida que en poco tiempo, 8 o 10 años, produce cirrosis. Lo habitual es que esta evolución se haga en un periodo de 20 o 30 años. La práctica repetida de biopsias hepáticas muestra una gran heterogeneidad entre los pacientes infectados crónicamente por VHC. En algunos casos las lesiones se mantienen estables durante años, en otros empeoran progresivamente y en otros alternan fases de empeoramiento y de mejoría. La progresión a cirrosis, parece producirse de forma gradual, por lo que la proporción de pacientes cirróticos aumenta con el paso de los años.. No se han comprobado diferencias claras en la evolución entre los pacientes con hepatitis por VHC adquirida por transfusión y la de adquisición esporádica .

    Con independencia de la evolución histológica, que puede ser muy evolucionada incluso en pacientes totalmente asintomáticos y con ALT normales,las manifestaciones clínicas de la hepatitis crónica por VHC se mantienen modestas a lo largo de los años. La mayoría de los pacientes siguen libres de síntomas o con mínimas molestias inespecíficas que rara vez interfieren con su actividad cotidiana. Esta ausencia de síntomas se comprueba no sólo en los pacientes que presentan lesiones hepáticas estables y mínimas sino también en los que progresan a la cirrosis, por lo que permanecer asintomático no garantiza una evolución favorable.

    La gran mayoría de los pacientes con hepatocarcinoma asociado al VHC padecen cirrosis. Sin embargo, aproximadamente un 3% de los hepatocarcinomas se desarrollan sobre hígados no cirróticos, A pesar de la ausencia de integración de este virus estos datos lo hacen pensar en la existencia de un efecto oncogénico directo del VHC. El intervalo entre la infección por VHC y la aparición del hepatocarcinoma es de 7 a 25 años.

    Para terminar, es posible que la aparición de mutantes que escapen a la vigilancia del sistema inmune explique en muchos casos la persistencia de la infección. Es así mismo posible que la infección por variantes genéticas con distinta capacidad aparecidas en el curso de la infección crónica bajo la presión del sistema inmune o adquiridas en el momento del contagio, pueda contribuir a explicar la marcada variabilidad evolutiva de la infección crónica por VHC.
 

DIAGNOSTICO DE LA INFECCIÓN POR VHC

 
Podemos dividir las pruebas de diagnóstico en dos grupos:

DIAGNOSTICO SEROLOGICO. DETECCION DE ANTICUERPOS

    La variedad de proteínas producidas durante el proceso de replicación del VHC produce una réspuesta serológica muy variada frente a él. No ha podido encontrarse una relación precisa entre los diferentes patrones de respuesta inmune y el estadío biológico o clínico de la infección. Unicamente sabemos con certeza que los anticuerpos frente al core (antígeno c22-c) y NS3 (c33-c) son los primeros en aparecer en los cuadros de primoinfección.
 

PRUEBAS SEROLOGICAS DE RASTREO

    Los métodos ELISA son los que están en uso. Contienen una mezcla de péptidos sintéticos o recombinantes, o una combinación de ambos, frente a los que se miden los anticuerpos IgG que tiene la muestra. Cuando se indica que un suero es reactivo con esta metodología se está diciendo que tiene anticuerpos frente a alguno o todos los antígenos empleados en la prueba pero no sabemos frente a cúal o cuales. Las pruebas serológicas han evolucionado con el tiempo mejorando su sensibilidad y especificidad. En la actualidad las diferentes marcas poseen diferentes mezclas de antígenos y son considerados de "3ª generación". Todas poseen antígenos derivados de la nucleocápside (c22-3), de la región no estructural NS3/NS4 (c33-c, c100-3. C200) y de alguna parte de NS5. (Figura 1). Con el empleo de estas pruebas se ha acortado el periodo de ventana de las primoinfecciones a unas 4 semanas y en el 80% de los casos el paciente es seropositivo a la cuarta semana del comienzo de la enfermedad.

    Han pasado a la historia "los ELISA de 1ª y 2ª generación"; nadie los emplea puesto que no se fabrican. Debemos de ser precavidos al interpretar datos epidemiológicos obtenidos con pruebas antiguas que en algunos casos carecían de la suficiente sensibilidad.

    Un resultado positivo indica exposición al VHC. En la mayoría de los casos se correlaciona con la presencia de ARN-VHC en la sangre por lo que es un marcador de alto valor predictivo de infección viral. Esto es especialmente cierto con las reactividades elevadas de anticuerpos obtenidas con ciertas marcas de ELISA. En un 20-25% de los casos, indica también exposición pasada y curada.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS TIPO IGM FRENTE AL VHC

    Se ha detectado respuesta de tipo IgM contra el antígeno "core", NS3 y NS4, que habitualmente coincide en el tiempo con la respuesta de tipo IgG. La respuesta más intensa de IgM está dirigida contra el antígeno del "core" y en algunos casos es el primer marcador que aparece tras la infección por el virus . La duración de la respuesta de IgM es habitualmente breve pero es frecuente seguir detectándola en la fase crónica de la enfermedad. En cualquier caso no se ha demostrado que la determinación de IgM anti-VHC en el diagnóstico de la infección aporte datos claros y concluyentes sobre la biología o estadío de la infección viral.
 

PRUEBAS CONFIRMATORIAS ANTICUERPOS

    Estas pruebas están diseñadas para conocer individualmente que antígenos virales son los responsables de la reactividad obtenida mediante una prueba de ELISA convencional. También ponen de manifiesto la especificidad de la reacción al poder descartar reactividades no debidas a antígenos virales. Se realizan sobre un soporte de nitrocelulosa a la que se han adherido estos péptidos en diferentes lugares. También soportan diferentes controles para asegurar el funcionamiento correcto de la prueba. La adición de la muestra y su revelado pondrá de manifiesto frente a que péptidos existen anticuerpos. La prueba solo puede leerse como:

    En el 97-99 % de los sueros anti VHC ELISA positivos tienen la prueba confirmatoria positiva. Las dos bandas más frecuentemente vistas son para los antígenos c33c y c22-3 aunque son posibles patrones de reacción muy diferentes. Al igual que pasó con los ELISAS tambíen estas pruebas han sido mejoradas tanto en sensibilidad como en especificidad.

    Con las pruebas de tercera generación (RIBAâ , IMNOLIAâ, MATRIXâetc) se siguen obteniendo algunos resultados indeterminados cuando intentamos "confirmar" la especificidad de la respuesta antigénica. Incluso puede darse el caso de que una muestra que con una marca presenta reactividad única para un péptido tenga, con otra marca, reactividad para otro péptido diferente o pueda incluso ser clasificada como positiva. Esto indica que la sensibilidad de las "Pruebas Confirmatorias" para diferentes anticuerpos es muy variable y por tanto el poder de clasificación de estas es limitado o confuso en sueros con índices ELISA bajos. Por tanto, los resultados clasificados como indeterminados son al menos cuestionables.

    Un confirmatorio positivo se correlaciona estrechamente con la presencia de RNA viral en suero y enfermedad hepática; sin embargo, conviene subrayar que en algunos pacientes la prueba de PCR no detecta ARN VHC. En muestras con prueba confirmatoria indeterminada o negativa también es posible la presencia de ARN. Esto último es especialmente cierto en los pacientes inmunosuprimidos o con alteraciones en la respuesta inmune. En el caso de que se descarten estas patologías deberá pensarse en una primoinfección.
 

MARCADORES DE INFECCION

    Fundamentalmente son dos los parámetros que el laboratorio puede determinar:

    Estas dos determinaciones son imprescindibles para la correcta monitorización de los tratamientos.
 

DETECCION DEL GENOMA VIRAL

    Para realizarla de forma que alcancemos su máxima sensibilidad se emplea la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Este método está diseñado para amplificar exclusivamente ADN. Por ello es necesario transformar previamente el ARN del virus en ADN (cDNA) para amplificarlo posteriormente.

    La prueba puede realizarse en sangre, tejido hepático y leucocitos pero siempre deberán cumplirse algunos requisitos importantes, que el médico especialista debe de conocer y que están especialmente encaminados a no obtener resultados falsamente negativos. La extracción de la muestra en tubo esteril y libre de RNAsas, son exigéncias imprescindibles. Para mantener la integridad del ARN la muestra de sangre siempre debe de centrifugarse en las dos horas posteriores a la formación del coágulo. No sirve plasma heparinizado. Las muestras para rutina, si no se van a procesar en el mismo dia, deben conservarse a una temperatura igual o inferior a -20ºC. Si se desea una conservación más prolongada deberán mantenerse a -70 ºC. Igualmente se evitarán repetidos ciclos de congelación-descongelación que pudieran alterar el genoma vírico: el ARN es muy lábil y fácilmente degradado por RNAsas ambientales.

    La cuantificación del ARN vírico en sangre puede realizarse de diferentes formas

    La extracción del ARN del suero es una de las etapas fundamentales especialmente cuando se trata de proceder a la cuantificación. Una mala extracción de ARN (recuperación) puede producir falsos negativos por lo que siempre deberá emplearse, en cada determinación, una señal o marcador que indique la eficiencia de la misma.. La obtención del ARN puede realizarse de diferentes formas. Una es la disrrupción mecánica o calórica. Es sencilla pero poco reproductible. Otra consiste en la lisis alcalina con enzimas y detergentes y una tercera, ya clásica, es el tratamiento con guanidina y precipitación con fenol. Es el procedimiento más laborioso y más sensible.

    La elección de uno u otro procedimiento se realiza en función de nuestras necesidades y utilización que queramos dar a la prueba por lo que habrá que barajar el rendimiento que necesitemos, la eliminación de inhibidores que puedan afectar a los enzimas de la PCR, la reproducibilidad y la rapidez, la manipulación en orden a evitar el riesgo de contaminaciones y por supuesto que haya sido comparado con métodos estándar. Todas estas técnicas pueden realizarse mediante un protocolo propio, con los problemas de estandarización que esto genera, o mediante kits comerciales que la garantizan.
 

INDICACIONES DE ESTAS TÉCNICAS

    Diversos estudios han puesto de manifiesto que el ARN del VHC se puede detectar en el suero de prácticamente la totalidad de los pacientes con infección aguda o crónica por el VHC. La positividad de la PCR del VHC en suero se produce muy tempranamente en el curso de la infección, por lo que constituye un método excelente para el diagnóstico precoz de la misma . La viremia desaparece en los individuos con infección aguda resuelta mientras que tiende a permanecer, a veces intermitentemente, durante años en los individuos que desarrollan infección crónica. Estudios recientes señalan que los títulos de viremia tienden a ser más altos en pacientes con enfermedad hepática crónica que en donantes de sangre asintomáticos, así como si la adquisición del virus ha sido post-transfusional, si existe inmunosupresión farmacológica y en la coinfección con el virus de la inmunodeficiencia humana, VIH. Los trabajos que investigan la relación del nivel de viremia y la severidad de la enfermedad hepática muestran resultados contradictorios ya que tanto títulos altos como títulos bajos se han relacionado con el grado de gravedad de la enfermedad.

    Las pruebas cualitativas pueden ser empleadas para el diagnóstico temprano de la infección VHC en pacientes con hepatitis pero que aún no han desarrollado los anticuerpos. Igualmente es válido para todas aquellas situaciones clínicas en las que el paciente sea incapaz de poner en marcha una respuesta inmune normal. Otra de las aplicaciónes es la monitorización del tratamiento y de la eficacia del mismo. La persistencia del ARN en el seno de un tratamiento indica que la terapeútica no ha sido la correcta o no está siendo efectiva. Mientras que su aclaramiento entre la cuarta y octava semana de tratamiento es una buena noticia en relación con la eficacia del mismo, su persistencia en este intervalo presagia casi con seguridad un fracaso terapeútico. Incluso la desaparición del ARN dentro del tratamiento más allá dela 8ª semana no garantiza la curación. Tambien esta prueba puede ser empleada para el estudio del riesgo de la transmisión vertical y de su ocurrencia y , finalmente, para diferenciar la superposición de patologías hepáticas. No es necesaria la realización de esta prueba en todos los seropositivos ya que la buena correlación que existe, especialmente en los enfermos con hepatitis crónicas, entre la seropositidad y la presencia de ARN (95%) no lo aconsejan. PCR ha mostrado ser el método más sensible para la detección de ARN de VHC.

    Con el desarrollo de las técnicas cuantitativas se ha podido establecer que el VHC tipo 1 produce mayores niveles de virémia que los otros tipos y que los pacientes infectados desarrollan o virémias permanentes y estables, con valores altos o bajos, o intermitentes con cifras irregulares y oscilantes. Parece establecido que el éxito del tratamiento depende, al menos en parte y junto con otros factores, de la concentración de virus al inicio del mismo.
 

DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO DEL VHC

    Existen diferentes procedimientos para su determinación. Cada técnica tiene sus limitaciones. Los métodos basados en la PCR de la región 5'UTR son muy sensibles pero hay que tener en cuenta que las diferencias entre los diferentes tipos son muy sutiles. RFLP diferencia entre los tipos pero no entre algunos subtipos. La metodología de Okamoto es laboriosa etc. Las técnicas para determinar el genotipo del VHC infectante son:

BASADOS EN LA PCR

BASADOS EN LA SEROLOGIA

    El conocimiento del genotipo nos aporta datos sobre la posible respuesta al tratamiento. Se sabe que el genotipo 1b es el peor respondedor mientras que 2a, 2b y 3a tienen un mejor pronóstico. La prevalencia en nuestro país del tipo 1b es la predominante (80%). En pacientes jóvenes europeos el tipo 3a parece tener una importante prevalencia. Tambien el genotipado es útil en los estudios epidémiologicos.
 

EVOLUCION DE LOS MARCADORES

Primoinfección

    En estos casos los anticuerpos pueden hacerse detectables entre las semanas 3 o 4 después del comienzo de la enfermedad pero puede alargarse como media a las 8 semanas (depende en gran parte de la dosis infectiva que aportó el mecanismo de transmisión). También puede detectarse IgM. El título más elevado de anticuerpos suele establecerse después que lo hayan alcanzado las ALT. En esta fase los anticuerpos están dirigidos fundamentalmente contra c22, c33-c, ambos muy antigénicos, y NS5.

    El ARN es detectable mucho antes de la seroconversión y su concentracion suele ir en incremento hasta que los anticuerpos alcanzan su meseta. Luego, si el paciente cura, desaparece rápidamente. Si evoluciona a la cronicidad su presencia puede ser o constante y con concentraciones oscilantes o intermitente con incrementos y descensos arbitrarios.

Curación a partir de una forma aguda

    Los anticuerpos van disminuyendo lentamente y pueden desaparecer entre los 12 o 24 meses aunque en ocasiones persisten más de 5 años. El ARN, al cesar la replicación se negativiza persistentemente. Esto debe de constatarse mediante la realización de PCR seriadas mientras existan anticuerpos. Si los anticuerpos desaparecen debe de repetirse la prueba para confirmar la buena evolución.
 

Curación a partir de una forma crónica (Tratamiento)

    En los pacientes que curan en esta fase siguen manteniendo la reactividad frente a c22 y c33c indefinidamente. Se desconoce el motivo de esta persistencia que puede ser debida a la larga estimulación antigénica que suspuso esta forma de enfermedad. El ARN igualmente es el primer marcador que se negativiza siendo necesaria la monitorización de esta prueba. En el caso de los pacientes tratados la persistencia de ARN, a títulos similares a los iniciales, es indicio de la poca eficacia de aquel. Si transcurridos 2 meses la situación persiste deberá reevaluarse la terapeútica. Una vez finalizado el tratamiento con respuesta aparente (aclaramiento del ARN) el paciente deberá ser monitorizado hasta al menos 6 ó 12 meses.

Cronicidad

    En esta forma de enfermedad la persistencia de los anticuerpos con cualquier patrón de respuesta, incluso con pruebas confirmatoris indeterminadas, son posibles. El ARN igualmente puede tener comportamientos imprevisibles alternando fases de gran concentración con otras de silencio. En estos casos ALT son marcadores muy útiles en el seguimiento.


 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

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Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL. Molecular Biology of the Hepatitis C viruses: Implications for diagnosis, development and control of viral disease. 1991. Hepatology. 2:381-389.

Rizzetto M,Feinstone SM, Bonino F, Brunnetto MR, baldi M, Rassam SW, Dusheiko GM, Genesca J, Esteban JL, Esteban R, Vander Poel CL, Reesink HW, Saracco G. Hepatitis C. 1991. Eurp J Gastroenterol and Hepatol. 3:569-606.

Simmonds P, McOmish F, Yap P, Chan SW, Lin C, Dusheiko G, Saeed A, Holmes E. Sequence variability in the 5' non-coding region of hepatitis C virus:Identification of a new virus type restrictions on sequence diversity. 1993. J.Gen Virology. 74:661-668.

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Tabla 2.- Nomenclatura y clasificación de los diferentes genotipos de VHC
 

Simmonds 

1a 

1b 

1c 

2a 

2b 

2c 

2d 

3a 

3b 

4a 

5a 

6 

Okamoto 

I 

II 

 

III 

IV 

             

Mori 

I 

II 

 

III 

IV 

   

V 

VI 

     

Cha 

G I 

G II 

 

G III 

G III 

   

G IV 

G IV 

 

G V 

 

Nakao 

Pt 

K 1 

 

K 2a 

K 2b 

   

K 3 

K 3 

     
                         

Prototipo d 

HCV 1 

HCV J 

 

HC J6 

HC Je 

   

E b1 

 

Z6 

SA 3 

HK 1 

 

HCV H 

CV BK 

HCVC 
         

Ta 

Tb 

EG 1 

SA 4 

HK 2 

 

HC J1 

HCV T 

         

BR 36 

HCV TR 

to 

SA 1 

HK 3 

   

HCV JK1 

         

BR 33 

 

EG 33 

SA 2 

HK 4 

   

HC J4 

         

HD 10 

 

BU 79 

SA 7 

 
   

HCV TA 

             

BU 74 

SA 11 

 
   

HCV JT 

             

GB 80