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Protocolos de Diagnóstico Serológico Clínico - Núm. 2

Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio Fuertes Ortiz de Urbina

Cortesía de Innogenetics Diagnóstica y Terapéutica, S.A.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
DE LA SÍFILIS

Introducción

La sífilis es una enfermedad infecciosa aguda o crónica cuyo agente causal es Treponema pallidum, perteneciente, junto con otros Treponemas, Borrelias y Leptospiras, a la familia de las Treponemataceas. Es un microorganismo móvil que dadas sus dimensiones, 5-15 m de largo por 0,2 m de diámetro, se encuentra en el límite de resolución óptica de los microscopios convencionales, por lo que no es posible visualizarlo mediante tinciones normales y sí por contraste de fases o tinciones de plata que "engruesan la bacteria". Tampoco es cultivable según el concepto tradicional. Su movilidad se debe a 10 flagelos periplásmicos. Su tiempo de generación en los tejidos humanos es de unas 8 horas por lo que su multiplicación es lenta.

La enfermedad está clasificada como venérea y de declaración obligatoria, siendo su mecanismo de transmisión el contacto directo con una lesión productiva. Después de un período de incubación de 12 a 90 días -una media de 21- aparece en el lugar de la inoculación una lesión primaria, rica en treponemas (el chancro), que desaparece espontáneamente a las pocas semanas. Durante este primer estadío (sífilis primaria) T. pallidum se multiplica en los linfáticos regionales distribuyéndose por la sangre a todos los órganos del individuo (infección sistémica). Generalmente las pruebas serológicas se hacen positivas en este período pasadas 3-4 semanas de la infección. En el paciente no tratado, el segundo estadío comienza con la aparición de una de las manifestaciones sistémicas de la enfermedad: una erupción en piel, palmas y plantas (roseola sifilítica) acompañada de síntomas generales y frecuentemente de otros signos localizados (condilomas genitales). Las lesiones abiertas de este período son muy contagiosas. Tras la primera desaparición espontanea de la misma y durante el primer y segundo año, pueden aparecen brotes similares cada vez de menor intensidad (fases de latencia precoz) hasta que desaparecen totalmente todos los signos y síntomas, (fase de latencia tardía). El tercer estadío de la enfermedad, que solo se presenta en unos pocos pacientes, se caracteriza por la formación de lesiones granulomatosas destructivas (gummas) que curiosamente tienen escasa carga treponémica. En este período pueden aparecer síntomas y signos de focalización de la enfermedad (neurosífilis, sífilis cardiovascular etc.).

El treponema también puede traspasar la barrera placentaria con suma facilidad a partir del tercer o cuarto mes de la gestación y producir enfermedad fetal; por ello, en la mayoría de los países, se realiza un estudio de anticuerpos frente a este patógeno para instaurar medidas preventivas.

En los estudios de evolución espontánea de la enfermedad, se ha visto que aproximadamente un 33% de los pacientes curan espontáneamente con negativización de las pruebas reagínicas. Otro 33% no desarrolla síntomas de progresión de la enfermedad aunque las pruebas no treponémicas permanecen positivas y otro 33% desarrolla una enfermedad tardía más o menos grave (17% sífilis tardía benigna, 8% neurosífilis y 8% sífilis cardiovascular).

DIAGNÓSTICO DIRECTO

La identificación de Treponema pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesión - campo obscuro y/o fluorescencia directa (DFA-TP)- es una prueba definitiva para asegurar el diagnóstico. Las ventajas de este tipo de métodos son la inmediatez y bajo coste. Este diagnóstico puede ser previo a la positivización de los test serológicos y es probablemente el de más rendimiento en la fase primaria, secundaria, recaídas y en la sífilis congénita cuando las lesiones son ricas en treponemas. Un resultado negativo en el examen directo del producto de la lesión NO DESCARTA la posibilidad de la enfermedad ya que pueden existir pocos treponemas en la misma dependiendo de los días de evolución y de la administración de tratamientos previos. Nunca deberá emplearse para el examen de lesiones sospechosas en la boca ya que las posibilidades de confundir los treponemas con otras espiroquetas saprofitas son muy altas. La sensibilidad de esta prueba es del 75-80%.

ESTADIOS Y EVOLUCIÓN DE LA SÍFILIS NO TRATADA

	ESTADIOS
	primario	secundario	latente precoz	latente tardío	terciario
Tiempo	3 semanas a 3 meses Media de 21 días	Seis semanas a seis meses	Uno-dos años	Dos a veinte años	Diez a veinte años
Serología	Variable	Positiva	Variable	Variable	Variable
Clínica	Chancro único o múltiple. Linfadenopatía regional. L.C.R. (+) en el 40%	Roseola sifilítica Pápulas. Lesiones musculares. Condilomas. Alopecia	Asintomático o Recaídas en el 25%.	Asintomático ¿Curación espontanea?	Gummas. Neurosífilis. Cardiovascular.
A partir del tercer mes de gestación: Posibilidad de infección fetal

Tabla 1

DIAGNÓSTICO INDIRECTO

A la vista de las dificultades existentes en la mayoría de las ocasiones para realizar el diagnóstico directo, el diagnóstico indirecto- serológico- de la enfermedad se ha convertido en el procedimiento más frecuente. Los marcadores serológicos necesitan aproximadamente de unos 14 a 20 días para hacerse reactivos.

Pruebas empleadas actualmente	Valores de referencia
No Treponémicas
R.P.R. (suero o plasma) (Floculación con carbón)	No reactivo
V.D.R.L. (sólo suero y L.C.R.) (Floculación)	No reactivo
U.S.R. (unheated Serum Reagin) (Floculación)	No reactivo
TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test) (suero o plasma)	Negativo
E.L.I.S.A. (basado en antígeno VDRL)	No reactivo
Treponémicas
TPHA (suero) (Hemaglutinación)	No reactivo
FTA-ABS IgG e IgM (suero y LCR)	No reactivo
FTA-ABS-DS (FTA de tinción doble)	< cut off
Anti-IgG (ELISA) (suero y LCR)	< cut off
Captia Anti-IgM (ELISA) (suero)	< cut off
Western Blot: Prueba confirmatoria

CARACTERÍSTICAS GENERALES Y PECULIARIDADES DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS

Pruebas no treponémicas:

• V.D.R.L. (Venereal Research Disease Laboratory). Unicamente puede emplearse con suero, es un antígeno no particulado. La reacción que se obtiene con la muestra positiva es de floculación. Lectura microscópica.
• R.P.R. (Rapid Plasma Reagin). Puede emplearse con suero y plasma. Es un antígeno con partículas de carbón.
• TRUST. (Toluidine Red Unheated Serum Test). Puede realizarse con suero o plasma. Es el mismo antígeno del VDRL con partículas coloreadas con rojo de toluidina.
• U.S.R. ( Unheated Serum Reagin). Puede emplearse con suero . El antígeno no es particulado y la reacción es de floculación. Lectura microscópica.
• E.L.I.S.A. Se emplea con suero. Utiliza en la fase sólida antígenos VDRL.

Todas ellas se basan en antígenos compuestos de soluciones alcohólicas con cantidades predeterminadas de cardiolipina, colesterol y lecitinas. Miden simultáneamente inmunoglobulinas IgG e IgM frente a estas sustancias que son producidas en los tejidos dañados por el treponema o por otros procesos. Puesto que no miden anticuerpos específicos frente al treponema su positividad no asegura la enfermedad sifilítica.

Para su realización el suero del paciente es mezclado con el antígeno en un soporte circular de diámetro standard, si existen anticuerpos se combinan formando una floculación que es leída microscópicamente - 100 aumentos- si no existen partículas de "visualización" o macroscópicamente si el reactivo lleva estas partículas. El VDRL y USR (que tiene el mismo antígeno del VDRL estabilizado con EDTA y colina) necesitan de un microscopio de 100 aumentos para su lectura y deberá realizarse meticulosamente tanto la preparación del antígeno como la lectura de la reacción. El antígeno VDRL debe prepararse frecuentemente aunque puede estabilizarse, para su conservación durante unos días, mediante la adición de ácido benzoico al 1%. USR es más estable. Como dato importantísimo diremos que solo VDRL está validado para estudiar anticuerpos no treponémicos en LCR y es el único útil para el diagnóstico de la neurosífilis

Todas ellas pueden presentar fenómenos de prozona - falsos negativos - cuando las muestras son fuertemente reactivas por ello es conveniente titularlas siempre. Esto es especialmente cierto cuando la prueba se realiza con muestra no diluida y con un procedimiento incorrecto como es el dispensar el antígeno sobre la muestra no extendida sobre el circulo de reacción. La temperatura de los reactivos es igualmente importantísima en relación con la sensibilidad. También puede obtenerse un resultado negativo en las fases muy tempranas del período primario, incluso cuando la visualización de los treponemas es positiva. Los falsos positivos no superan por lo general los títulos de 1/4 y pueden ser transitorios o permanentes según persistan o no más de seis meses. Muestras hemolizadas o lipémicas pueden producir también este tipo de resultados. La prueba RPR produce títulos más elevados que VDRL. Cuando se emplean para estudiar poblaciones todos los sueros reactivos deberán confirmarse con una prueba treponémica. La sensibilidad de estas pruebas en los períodos primario, secundario, latente y tardío se muestran en la tabla 2.

Las pruebas reagínicas son fundamentales para evaluar la eficacia de los tratamientos. Si este es correcto y eficaz los títulos deberán disminuir significativamente (hasta 8 veces) durante los 6-12 meses siguientes al inicio del tratamiento quedando, frecuentemente, reactividades persistentes a títulos muy bajos o en suero puro. Si el tratamiento se inicia en estadíos latentes o tardíos solo se obtiene disminución de los títulos, y de forma muy lenta, en un 25-40 % de los pacientes. En todos estos enfermos la persistencia de la seropositividad no indica ni fallo del tratamiento ni reinfección.

Pruebas treponémicas:

• FTA-ABS 200. (Inmuno fluorescencia indirecta con absorción del suero) Antígeno de treponema cepa Nichols y absorbente cepa Reiter. Se realiza con suero y L.C.R.
• FTA-ABS 200 DS. (Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble tinción).Antígeno de treponema cepa Nichols y absorbente cepa Reiter. Se realiza con suero y L.C.R. Emplea como antisuero una IgG marcada tetrametil rodamina-Isotiocianato y como contraste un suero anti-treponema marcado con FITC.
• TPHA. (Microhemaglutinación). Solo homologada para suero. Eritrocitos sensibilizados con antígenos de treponema cepa Nichols y absorbente de cepa Reiter.
• Captia sífilis M. (ELISA de captura anti cadena pesada). Se realiza en suero. Su utilidad está demostrada para el diagnóstico de sífilis congénita, fundamentalmente sintomática,y parece ser la prueba con mayor sensibilidad para la detección de esta clase de inmunoglobulina.
• ELISA IgG. Para utilizar con suero. Existen muchos estudios que demuestran su alta sensibilidad y especificidad.
• FTA-ABS 19S IgM. Para suero. Poca sensibilidad.
• FTA-ABS LCR. Utilizar LCR diluido a 1/5
• Western blot. Prueba de confirmación.

Estas pruebas fueron principalmente utilizadas para confirmar como verdaderos los resultados positivos obtenidos con las pruebas reagínicas. Producen escasos falsos positivos (un 1% FTA-ABS y muy pocos TPHA) especialmente en situaciones tales como mononucleosis, ADVP, lepra, enfermedades del colágeno, borreliosis y otras treponematosis patógenas. Todas ellas deben realizarse con una adsorción previa del suero para eliminar la reacción cruzada con otros treponemas. Estas pruebas no son útiles para monitorizar los tratamientos ya que suelen permanecer positivas en el 85 - 90% de los pacientes tratados y curados. FTA-ABS, en sus diferentes variantes, es una prueba compleja y está sometida a múltiples causas de error si no se estandarizan previamente todos los reactivos entre si. Igualmente la lectura es menos objetiva. Presenta aproximadamente un 1% de falsos positivos. TPHA es uno de los métodos más sencillos de realizar ensayándose la muestra a una dilución de 1/80 no estando demostrada la utilidad de cuantificar el resultado; tampoco esta homologada para su empleo en LCR. Produce menos falsos positivos que FTA-ABS existiendo estudios que demuestran su utilidad como prueba de rastreo. La sensibilidad para suero de estas pruebas en los diferentes estadíos varía entre 76 y 80 % para el estadío primario, 100% para el secundario, 97-100% para el latente y 94-96% para la tardía.

ELISA captia sífilis IgM es una prueba que se utiliza para el diagnóstico de sífilis congénita. La prueba se realiza en suero y existen trabajos que demuestran mayor sensibilidad que FTA-ABS IgM 19S en el diagnóstico de esta forma clínica en estadíos tempranos sintomáticos y algo menor en los estadíos tardíos. En las sífilis congénitas asintomáticas la sensibilidad de todas las pruebas para IgM son muy bajas de tal forma que SÓLO UN RESULTADO POSITIVO CONFIRMA EL DIAGNOSTICO. En cualquier caso los resultados negativos obtenidos con esta prueba deberán interpretarse junto con los datos que se tengan sobre el período de la enfermedad en el que inició el tratamiento en la madre, si este fue correcto o no y los signos y síntomas del recién nacido. Su negatividad no descarta la enfermedad congénita (Ver "sífilis congénita).

Las pruebas de ELISA IgG pueden emplearse en sustitución de las treponémicas TPHA y FTA-ABS ya que diferentes estudios han demostrado su excelente sensibilidad y especificidad en la detección de este tipo de anticuerpos. Estas pruebas permiten la automatización de grandes cantidades de muestras y lecturas objetivas.

El empleo de FTA-ABS IgM en suero para el diagnóstico de sífilis aguda o congénita está cuestionado. Es un procedimiento no aconsejable ya que carece de sensibilidad y especificidad. Su empleo, en todo caso la modificación FTA-ABS 19S IgM, debería ir precedida de un fraccionamiento del suero aunque esto no modifica su falta de sensibilidad (30-35% de falsos negativos), por ello únicamente UN RESULTADO POSITIVO DE ESTA TÉCNICA CONFIRMARÍA EL DIAGNÓSTICO.

Para el diagnóstico de la neurosífilis se acepta que una prueba FTA-ABS LCR negativa, más sensible que VDRL en este período, descarta la enfermedad. (Ver "neurosífilis)

El Western Blot tiene una gran utilidad en la confirmación de enfermedad congénita cuando empleamos como revelador de la reacción anti-IgM (sensibilidad del 90% y especificidad del 83%).

PRUEBAS SEROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA SÍFILIS

Sensibilidad y especificidad en diferentes estadíos

	Primaria	Secundaria	Latente	Tardía	Especificidad
VDRL	78%	100%	95%	71%	98%
RPR	86%	100%	98%	73%	98%
USR	84%	100%	97%	-	99%
TRUST	85%	100%	95%	-	93%
FTA-ABS DS	80%	100%	100%	96%	98%
TPHA	76%	100%	97%	94%	99%
Captia IgM*	90%	-	-	-	90%

Tabla 2. * Para Sífilis congénita sintomática

USO CLÍNICO DE LAS PRUEBAS DE SÍFILIS

Existe la creencia de que la utilización de las pruebas diagnósticas está predeterminada en el sentido de emplear las "reagínicas" para testar gran número de muestras y las treponémicas para confirmar los resultados positivos obtenidos con aquellas. Este proceder que probablemente es aceptable para rastrear poblaciones con baja prevalencia de enfermedad (donantes de sangre) no es tan claro en los pacientes de riesgo, con clínica compatible o sospecha de enfermedad. Ante el diagnóstico de la infección deberemos tener presente que:

1. Realizar en suero solo pruebas no treponémicas puede conducirnos a obtener falsos negativos en sífilis latentes tardías o en los períodos terciarios de la enfermedad.
2. Ensayar los sueros únicamente con pruebas treponémicas puede llevarnos a falsos negativos en los estadios primarios de la infección.
3. Ambas pruebas, por separado, pueden producir falsos positivos por lo que el valor predictivo positivo individual (VPP) de cada una de ellas se ve disminuido.
4. Por último no podemos olvidar que aunque las pruebas se realicen conjuntamente la positividad en solitario de una de ellas puede tener significado clínico.

Sífilis Primaria

• Las pruebas serológicas no se hacen positivas hasta pasadas 1-4 semanas de la aparición del chancro.
• TPHA es menos sensible que FTA-ABS en este período y probablemente ambas menos sensibles que VDRL o RPR.
• Lesiones clínicas compatibles con este período. El diagnóstico directo es posible.

Sífilis secundaria

• Pruebas reagínicas y treponémicas positivas en el 100 % de los casos.
• Lesiones de secundarismo. El diagnóstico directo es posible.

Sífilis latente precoz / de menos de un año de evolución

• Pruebas reagínicas y treponémicas positivas. Caída lenta pero progresiva de los títulos de las pruebas reagínicas con el paso del tiempo que pueden llegar a negativizarse.
• Historia de lesión típica de secundarismo de menos de un año.
• No es posible el diagnóstico directo

Sífilis latente tardía / de más de un año de evolución

• Pruebas treponémicas positivas.
• Pruebas reagínicas positivas o negativas según el tiempo de evolución.
• No existen síntomas clínicos.(Evaluar serológicamente para neurosífilis).

Sífilis terciaria

• Prueba treponémica positiva en el 95 % de los casos.
• Pruebas reagínicas negativas en el 30 % de los pacientes
• Síntomas clínicos de terciarismo: Gummas, sífilis cardiovascular, neurosífilis etc.

Criterios de diagnóstico para la Neurosífilis

• Prueba treponémica positiva en suero.
• VDRL positivo en LCR. (75 %)
• Aumento de la celularidad en LCR (> de 5-10 células mononucleares / ml.)
• Proteínas a concentraciones superiores a 40 - 100 mg/dl (Sólo en el 30-40%)

Con el tratamiento deben descender las células a valores normales seguido de la normalización de la proteínas. El estudio seriado del título de VDRL no siempre muestra un descenso.

Sífilis en embarazadas y congénita

• En el embarazo existen con las pruebas no treponémicas resultados falsos positivos.
• Durante la gestación es posible una elevación de los títulos del las pruebas reagínicas en una paciente que haya padecido una sífilis. Esto no significa que exista necesariamente una reinfección o una recaída. En estos casos es fundamental una buena reevaluación clínica.
• Sólo en el 20% de los niños infectados intraútero los títulos de las pruebas no treponémicas son superiores a los de la madre. Por ello los títulos reagínicos inferiores a los de la madre no descartan la infección congénita. También se debe de tener presente que si la infección ocurrió en el tercer trimestre de la gestación VDRL puede ser negativo en el recién nacido.
• Los anticuerpos reagínicos y treponémicos transferidos al neonato, de clase IgG, se deben aclarar en el plazo de 12 a 18 meses. El incremento o mantenimiento del título de los anticuerpos reagínicos a lo largo de los primeros 6 meses de vida indican infección congénita. Igualmente la presencia de IgM mediante captia ELISA o FTA-ABS 19S confirmaría el diagnóstico
• La mejor evaluación de sífilis congénita se puede realizar con el estudio del LCR del recién nacido en el que detectaremos alteraciones celulares, positividad del VDRL y posiblemente FTA-ABS positiva.
• La sangre de cordón no es una buena muestra para el diagnóstico.

SÍFILIS: BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Guidelines for evaluation and acceptance of new syphilis serology test for routine use. 1977. Centers for Disease Control

Demonstration of specific 19S(IgM) antibodies in untreated and treated syphilis. Comparative studies of the 19S(IgM) FTA test, the 19S(IgM) TPHA test, and the solid phase haemadsorption assay. F.Muller and EG. Lindenschmidt. Br.J.Vener Dis 1982. 58: 12-17.

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