PREPARACIóN DE LAS DILUCIONES A PARTIR DE LA MUESTRA DE SUELO

Dilución madre (10^-1): Pesar en condiciones asépticas 10 g de suelo en bolsa de Stomacher y resuspender en 90 mL de agua de peptona estéril. Agitar durante 60 segundos a velocidad máxima.
Diluciones seriadas: Transferir 1 mL de la dilución madre a¬ 9 mL de agua de peptona estéril (10^-2) Agitar en Vortex 15 segundos.
Transferir 1 mL de la dilución 10^-2 a 9 mL de agua de peptona estéril (10^-3)
Agitar en Vortex 15 segundos.

SIEMBRA. Sembrar en superficie en medio Agar Sabouraud Cloranfenicol, por triplicado, 0,1 mL de las diluciones de suelo 10 ^-110 ^-2 y 10 ^-3 .
Incubar las placas en estufa a 28 ºC durante 24-48h.

RECUENTO
Seleccionar las placas de la dilución donde hayan crecido entre 20 y 200 colonias por placa. Realizar el recuento de las colonias crecidas y calcular la media.
Calcular las unidades formadoras de colonia (ufc) en 1 gramo de la muestra de suelo original teniendo en cuenta la cantidad sembrada en cada placa y la dilución de la muestra sembrada.
Cálculos: El número de ufc/g de muestra es igual a la media del número de colonias por el factor de dilución (inverso de la dilución) y por 10.

AISLAMIENTO
Una vez realizado el recuento de las colonias que crecen en Sabouraud Cloranfenicol relizamos el aislamiento en cultivo puro mediante la técnica de siembra por agotamiento en estría de diferentes colonias e incubamos a 28 ºC durante 24-48 h.

OBSERVACION EN FRESCO
Depositar una gota de agua estéril en un porta. Extender una colonia de levadura con asa de siembra y fijar a la llama. Cubrir la preparación con un cubre y observar al microscopio con el objetivo 40x

TINCIóN SIMPLE
Depositar una gota de agua estéril en un porta. Extender una colonia de levadura con asa de siembra y fijar a la llama. Añadir una gota de azul de metileno y teñir durante 1 minuto. Lavar la preparación con alcohol de 96° y posteriormente con agua. Dejar secar y observar al microscopio con el objetivo 40x. Añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo 100x

TINCIóN NEGATIVA
Depositar una gota de nigrosina en un porta. Extender una colonia de levadura con asa de siembra y fijar a la llama. Dejar secar y observar al microscopio con el objetivo 40x. Añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo 100x

TINCIóN DE GRAM
Depositar una gota de agua estéril en un porta. Extender una colonia de levadura con asa de siembra y fijar a la llama. Seguir el protocolo de la tinción de Gram con Cristal Violeta (2 minutos), Lugol (1 minuto), lavado con alcohol de 96° (1 minuto) y Safranina (1 minuto). Dejar secar y observar al microscopio con el objetivo 40x. Añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo 100x

 

GALERíA API 20 C AUX.
A partir de una colonia crecida en agar Sabouraud. Inocular una galeria API 20C AUX.
La galería API 20 C AUX (bioMérieux) se compone de 20 cúpulas con sustratos deshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilación. Las cúpulas se inoculan con un medio mínimo semisólido y las levaduras sólo se reproducen si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente.
Permite identificar un total de 34 especies diferentes.
La lectura de estas reacciones se hace por comparación con un control de crecimiento y la identificación se obtiene, a partir de un código numérico, mediante un catálogo analítico o un programa informático

PROCEDIMIENTO
1. A partir de un cultivo joven de la levadura a identificar, realizar una suspensión en 2 ml de agua destilada estéril hasta obtener una turbidez igual a 2 de McFarland.

2. Transferir 100 microlitros (2 gotas) de esta suspensión a una ampolla de C Medium y homogeneizar evitando la formación de burbujas.
3. Llenar las cúpulas con la suspensión anterior evitando la formación de burbujas y creando un nivel horizontal para generar resultados correctos.
4. Incubar a 28-30 ºC durante 48-72 h.

LECTURA E INTERPRETACIóN.
Observar el crecimiento de las levaduras en comparación con la cúpula del control negativo. Una cúpula más turbia que el testigo indica una reacción positiva que debe anotarse en la hoja de resultados.

INTERPRETACIóN DE LOS TRIPLETES.
En la hoja de resultados, los diferentes nutrientes están separados en grupos de tres y se adjudica a cada uno, en caso de ser positivo, un valor diferente: 1 para el primero, 2 para el segundo y 4 para el que ocupa el tercer lugar.
Sumando cada triplete se obtiene un número de siete cifras que constituye el perfil numérico. El séptimo dígito se obtiene teniendo en cuenta los resultados de la observación al microscopio de las hifas.

IDENTIFICACIóN
La identificación debe hacerse mediante el Catálogo Analítico o el Programa Informático de Identificación suministrado por el fabricante.