Recuento de hongos filamentosos y levaduras


Recuento de Hongos Filamentosos y Levaduras

Apartados de este ejercicio

A. Introducción
B. Medios de cultivo y reactivos
C. Preparación de la muestra y diluciones decimales
 D. Siembra e incubación
E. Lectura de las placas y recuento de colonias sospechosas
F. Supuesto práctico
G. Comprobar respuestas


A. Introducción


Los hongos son organismos eucariotas que se engloban en el reino Fungi (Hongos).
Son heterótrofos y requieren materiales orgánicos que utilizan como fuente de energía y como esqueletos carbonatados para la síntesis celular. Están ampliamente distribuidos por la naturaleza, encontrándose en hábitats muy diversos de ahí su frecuente aparición como alterantes en alimentos.
Se reproducen de forma sexual y asexual. Presentan dos formas principales: hongos filamentosos y hongos levaduriformes; cuya estructura puedes ser pluricelular (típicamente filamentos) o unicelular (principalmente levaduras).


En alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, los hongos filamentosos y las levaduras crecen con mayor rapidez que las bacterias provocando importantes pérdidas por alteración de frutas frescas, vegetales, quesos, productos derivados de los cereales, alimentos salazonados y encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas.

En alimentos no ácidos que conservan humedad, los hongos filamentosos y las levaduras crecen más lentamente que las bacterias y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos.

En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse números reducidos de esporas y levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado.

Las levaduras crecen más rápidamente que los hongos filamentosos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras que los hongos filamentosos son casi siempre aerobios estrictos las levaduras crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.


En la actualidad, los métodos recomendados para el recuento total de hongos filamentosos y levaduras son los clásicos métodos de recuento en placa a partir de diluciones decimales seriadas de la muestra. Es posible realizar un recuento simultaneo de de hongos filamentosos y levaduras ya que, dada la naturaleza filamentosa de los hongos ambos forman colonias diferentes.

Se han descrito muchos medios de cultivo para dicho recuento, pero ninguno de ellos permite el recuento de todos los de hongos filamentosos y levaduras ni en todos los alimentos. La norma ISO 21527 recomienda el uso del agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC; Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol agar) en muestras de alimentos con una actividad de agua alta y el Diclorán 18% Glicerol (DG18; Dichloran 18% Glycerol agar) en las que tengan una actividad de agua inferior o igual a 0,95.


En este ejercicio, veremos el método para determinar el "Número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de hongos filamentosos y levaduras por gramo de alimento" según la Norma ISO 21527:

En productos con actividad de agua (aw) superior a 0,95 el recuento se realiza en agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC; Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol agar) y
En productos con aw menor o igual a 0,95 en agar Diclorán 18% Glicerol (DG18; Dichloran 18% Glycerol agar)

 

 


B. Medios de cultivo y reactivos

-Diluyente: Agua de triptona al 0,1%.

-Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)

El agar DRBC es un medio de cultivo selectivo para el recuento de hongos filamentosos y levaduras en alimentos de acuerdo a la Norma ISO 21527-1:
- La combinación de diclorán y rosa de bengala restringe notablemente el desarrollo colonial de los hongos filamentosos de esta forma se reprime que el crecimiento exacerbado de algunas colonias enmascara a las más lentas y, al mismo tiempo, facilita el recuento.
-La presencia de cloranfenicol y el reducido pH (5,6) impide el crecimiento de las bacterias.

Si quiere ver la composición del medio acceda a este enlace.

-Agar Diclorán 18% Glicerol (DG18)

El agar DG18 es un medio de cultivo selectivo para el recuento de hongos filamentosos y levaduras en alimentos con baja actividad de agua de acuerdo a la Norma ISO 21527-2:
- La presencia de diclorán restringe el desarrollo colonial de los hongos filamentosos de esta forma se reprime que el crecimiento exacerbado de algunas colonias enmascara a las más lentas y, al mismo tiempo, facilita el recuento.
-El cloranfenicol impide el crecimiento bacteriano.
- El glicerol reduce la actividad de agua de 0,99 a 0,95.

Si quiere ver la composición del medio acceda a este enlace.

 


C. Preparación de la muestra y diluciones decimales

Alimentos sólidos

Preparar la dilución inicial o dilución 10-1 (1/10);
Pesar 10 gramos de muestra en una bolsa de Stomacher, previamente tarada, mezclar con 90 mL de agua de triptona al 0,1%. (x gramos de muestra + 9x mL de diluyente) y homogeneizar en el Stomacher durante 1 a 3 minutos.

 

A partir de la dilución inicial, preparar diluciones decimales seriadas, tomando 1 mL de la dilución 10-1 y descargándolo en 9 mL de agua de triptona al 0,1%. y así, sucesivamente. Mezclar cada dilución en una agitador mecánico tipo Vortex.

Obtenemos la batería de diluciones decimales de la muestra 10-2, 10-3, 10-4, etc.

 

En el recuento de Hongos filamentosos y levaduras, así como en futuros recuentos de otros parámetros, el número de diluciones a realizar depende de:

- Si queremos conocer la flora del alimento respecto al parámetro que estemos analizando, en cuyo caso dependerá del número de microorganismos que se espera encontrar, cuanto mayor sea el número de microorganismos que esperamos más diluciones decimales deben hacerse del alimento.

- Si queremos conocer si la muestra que estamos analizando cumple un límite microbiológico establecido en la legislación, en cuyo caso dependerá del valor de dicho límite.


D. Siembra e Incubación

Siembra mediante extensión en superficie


Alimentos con aw>0,95: huevos, carne, derivados lácteos (excepto leche en polvo), frutas, vegetales, pastas frescas, etc.
Alimentos con aw≤0,95: frutos secos, jamón, cereales, productos de repostería, especias, etc.

Como hemos dicho, dependiendo de la aw del alimento se utiliza un medio u otro para el recuento;
Transferir con una pipeta estéril 0,1 mL de cada dilución de la muestra a placas de Petri bien con agar DRBC o bien con DG18.

Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilución.

Extender cuidadosamente el inóculo sobre la superficie de la placa con la ayuda de una varilla de vidrio acodada y estéril (asa de Drigalski).

Incubación
Incubar a las placas de agar a 22-25 ºC durante 5 días. Las placas se incuban en posición normal (no invertida) porque las colonias de levaduras y hongos filamentosos crecen mejor de esta manera.

 


E. Lectura de las placas y recuento de colonias

Interpretación de los resultados

Después de la incubación, examinar las placas:

Colonias típicas de Hongos filamentosos: colonias de aspecto algodonoso de diverso tamaño y color.

Colonias típicas de levaduras: colonias convexas, suelen ser brillantes y de color crema o rosa pálido.

 

 
Recuento de colonias sospechosas

Seleccionar las placas que presentan menos de 150 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Contar las colonias de las placas seleccionadas. No debemos hacer identificación/comprobación de las colonias.

Calcular el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro, según la siguiente expresión:

 


F. Supuesto práctico

Muestra #1

Se hace un recuento de hongos filamentosos y levaduras en una muestra de bizcocho de chocolate. Observe las placas y después conteste a las preguntas.

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes
(haga clic sobre la imagen para ampliar)

  Duplicado A Duplicado B
Dilución 10-1
Dilución 10-2
Dilución 10-3

Preguntas
Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción que considere correcta
 


1- Para realizar el recuento de hongos filamentosos y levaduras en la muestra de bizcocho:

a) Utilizar el agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol, ya que la muestra tiene una aw ≤0,95
b) Utilizar el agar Diclorán 18% Glicerol, ya que la muestra tiene una aw ≤0,95
c) Utilizar el agar Diclorán 18% Glicerol, ya que la muestra tiene una aw >0,95
 


2- A la vista de los resultados, para realizar el recuento de hongos filamentosos y levaduras, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g:

a) Dilución 10-1 y 10-2
b) Dilución 10-2 y 10-3
c) Dilución 10-2
 


3- Finalmente, el Número de Unidades Formadoras de Colonia de hongos filamentos y levaduras por gramo de muestra es:

a) 3,8 x 102 UFC/g
b) 3,8 x 103 UFC/g
c) 4,5 x 103 UFC/g

 

Muestra #2

Se hace un recuento de hongos filamentosos y levaduras en una muestra de fresas. Observe las placas y después conteste a las preguntas.

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes
(haga clic sobre la imagen para ampliar)

Dilución 10-1
Dilución 10-2
Dilución 10-3

Dilución 10-4

Preguntas
Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción que considere correcta


4- A la vista de los resultados, para realizar el recuento de hongos filamentosos y levaduras, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g:

a) Dilución 10-2 y 10-3
b) Dilución 10-3
c) Dilución 10-4


5- Finalmente, el Número de Unidades Formadoras de Colonia de hongos filamentosos y levaduras por gramo de muestra es:

a) 2,5 x 106 UFC/g
b) 2,5 x 105 UFC/g
c) 2,5 x 104 UFC/g

 


G. Comprobar respuestas

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