| Fundamento |
El número de microorganismos presentes en un fluido (muestra líquida) puede determinarse mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra. |
| Consiste en hacer pasar un volumen determinado de una muestra líquida
a través de un filtro de membrana microporosa en cuya superficie quedarán retenidos los micoorganismos, colocado en un equipo de filtración. |
 |
Tras la filtración, el filtro se coloca
sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo apropiado y se incuba el tiempo/temperatura
adecuados según
el tipo de microorganismos que se necesite analizar.
Las bacterias formarán colonias sobre la superficie de los filtros. |
 |
Esta técnica no puede aplicarse en aquellos líquidos que muestran elevada
viscosidad o materia en suspensión, pues el filtro de membrana se obstruiría
antes de que pudiera filtrarse una cantidad de muestra suficiente.
|
| Aparatos de filtración |
El aparato de filtración consiste
de un disco incrustado sostenido por soporte de goma o caucho y que se ajusta a una
base donde puede fijarse un embudo graduado.
El disco incrustado o perforado sostiene
el filtro de membrana (portafiltros). |
 |
El montaje que sujeta el filtro se coloca
encima de un matraz Erlenmeyer que tiene un brazo lateral (matraz Kitasato) conectado a un sistema de vacío (bomba de vacío).
|
 |
| También se puede montar una serie de estos conjuntos en forma múltiple (rampa de filtración), conectados
a un mismo extractor (bomba de vacío), permitiendo de ese modo que se filtren varias muestras a un
mismo tiempo. |
 |
| Filtros de membrana |
Los filtros de membrana son filtros
de superficie con una estructura microporosa precisa. Durante
la filtración, los micoorganismos con un tamaño mayor que los poros de la membrana son
retenidos en la superficie de la misma; si bien las partículas y microorganismos más
pequeños pueden pasar a través del filtro.
Por lo general, los filtros están compuestos de ésteres de
celulosa. |
 |
| Dispensador de filtros de membrana |
 |
En la mayoría de los análisis se utilizan filtros con un tamaño de poro de 0,45 micras (ya que la mayoría de las bacterias tienen un tamaño superior); aunque existen excepciones, como por ejemplo Legionella spp. para cuyo análisis se utilizan filtros de membrana con un tamaño de poro de 0,22 micras.
|
| Medios de cultivo |
Se suelen utilizar medios selectivos y diferenciales que permitan seleccionar y diferenciar el grupo de microorganismos que se trata de investigar.
|
Generalmente son medios solidificados a base de agar en una placa de Petri de 45 mm de diámetro |
 |
Tambien se utilizan caldos embebidos en una almohadilla absorbente en una placa ( PetriPad). |
 |
Existen sistemas de un solo uso (EZ), en los que el embudo, la membrana y la almohadilla constituyen un sistema compacto para filtrar, incubar y desechar. |
 |
| Volumen de muestra |
El volumen máximo de muestra depende de la filtrabilidad del agua. Esta técnica es adecuada para aguas que contengan pequeñas partículas o materia coloidal en suspensión, como el agua potable.
Con las membranas de 0,45 micras de poro, es posible filtrar varios litros de agua de este tipo. Por tanto, se trata de un ensayo de gran sensibilidad. |
Por otra parte, se debe seleccionar un volumen de muestra (o dilución de la misma) tal que permita obtener entre 10 y 200 colonias aproximadamente sobre la membrana (de 47-50 mm de diámetro).
|
| Recuento |
El recuento y la expresión de resultados se realiza igual que cuando se hace recuento en placa con la diferencia de que:
- En el recuento sin confirmación de colonias, el número total de colonias en las placas seleccionadas debe estar comprendido entre 10 y 200 y
- - En el recuento con confirmación de colonias; el número de colonias sospechosas en las placas seleccionadas debe estar comprendido entre 10 y 100
|
|
| Recuentos en los que no debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas. |
En los casos en los que no debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas.
Seleccionar las placas de todas las diluciones donde el número de colonias totales esté comprendido entre 10 y 200.
También, si todas las placas contienen menos de 10 colonias, pero el número total de colonias es mayor o igual a 4, aunque en este caso el resultado se da como número estimativo.
Sin embargo, cuando el número total de colonias oscila entre 1-3 colonias, expresar el recuento como: "Organismo presente en el volumen de referencia en un número inferior a 1/Vtot por volumen de referencia"
Cuando no crecen colonias en ninguna de las placas, expresar como: "Menos de 1/Vtot por volumen de referencia".
Si, además, Vtot es igual a Vs (porque se realiza el recuento en una sola placa en la que se filtra el volumen de referencia a partir de la muestra sin diluir), se puede expresar como:
- 0 UFC/Volumen de referencia
- Organismo no detectable /Volumen de referencia
Esto suele ser muy frecuente cuando analizamos
muestras de aguas para comprobar su potabilidad. También cuando analizamos aguas embotelladas para comprobar que cumplen la legislación.
|
Ejemplo |
Tras la filtración de 100 mL de una muestra/dilución de agua, se obtienen los siguientes resultados:
| |
Sin diluir |
Dilución 10-1 |
Dilución 10-2 |
Dilución 10-3 |
| Número de Colonias |
>200 |
38 |
5 |
0 |
Seleccionaremos las diluciones con entre 10 y 200 colonias, en este caso las diluciones 10-1
|
Aplicar las fórmulas:
Siguiendo el ejemplo tendremos que:
La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas (z) para el recuento será: z = 38
Volumen de referencia (Vs) seleccionado para expresar la concentración de microorganismos en la muesta; generalmente se expresa por el volumen filtrado (100 mL, 250 mL, etc.) cuando e realzan recuentos mediante filtración de membrana.
Siguiendo con el ejemplo, el Vs = 100 mL (ya que se trata de filtración).
Volumen total de muestra inoculado en las placas seleccionadas para el recuento (Vtot):
El número de placas seleccionado por dilución, siguiendo con el ejemplo, será n1 = 1, ya que se ha seleccionado una placa de una única dilución.
El volumen del inóculo aplicado a cada placa (ya que se trata de filtración) depende del volumen filtrado:
En este caso el volumen filtrado de cada muestra o dilución es de 100 mL por tanto, siguiendo con el ejemplo, será V1 = 100 mL
El nivel de dilución depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y será:
d=1; cuando la dilución menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (sólo para muestras líquidas o muestras de agua)
d=0,1;
cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la primera dilución, dilución 1/10 ó 10-1
Y así sucesivamente.
Siguiendo con el ejemplo, será d1 = 0,1, ya que las placas seleccionadas para realizar el recuento son las de la dilución 10-1
Siguiendo con el ejemplo, por tanto Vtot se calculará: Vtot= (n1V1d1 ) = (1*100*0,1) =10 mL
|
Por tanto tendremos:
Cs = (38/10)*100 = 380 UFC/100 mL. Redondeando: Cs = 3,8 x 102 UFC/100 mL
|
| Recuentos en los que debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas |
En los casos en los que debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas.
Seleccionar las placas de todas las diluciones donde el número de colonias sospechosas esté comprendido entre 10 y 100.
También, si todas las placas contienen menos de 10 colonias sospechosas, pero el número total de colonias es mayor o igual a 4, aunque en este caso el resultado se da como número estimativo.
Sin embargo, cuando el número de colonias sospechosas confirmadas oscila entre 1-3 colonias, expresar el recuento como: "Organismo presente en el volumen de referencia en un número inferior a 1/Vtot por volumen de referencia"
Cuando no se encuentran colonias sospechosas en ninguna de las placas, expresar como: "Menos de 1/Vtot por volumen de referencia".
|
Ejemplo |
Ejemplo; tras la filtración de 100 mL de una muestra/dilución de agua, se obtienen los siguientes resultados:
| |
Sin diluir |
Dilución 10-1 |
Dilución 10-2 |
| Número de Colonias |
180 colonias totales
23colonias sospechosas |
26 colonias totales
4 colonias sospechosas |
4 colonias totales
0 colonias sospechosas |
Seleccionaremos las diluciones con entre 10 y 100 clonias sospechosas, en este caso la muestra sin diluir
|
Aplicar las fórmulas:
Siguiendo el ejemplo, si suponemos que sometemos a confirmación a 10 colonias y que 8 de ellas cumplen con los criterios de confirmación, es decir resultan confirmadas, tendremos que:
La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento será: z = 23
El número de colonias sospechosas que se someten a confirmación son 10; n = 10
El número de colonias que resultan confirmadas. Es decir, el número de colonias de las resembradas que responden a los criterios de identificación son 8; k = 8.
Por tanto, el número de colonias confirmadas será x = 18,4
Volumen de referencia (Vs) seleccionado para expresar la concentración de microorganismos en la muesta; generalmente se expresa por el volumen filtrado (100 mL, 250 mL, etc.) cuando e realzan recuentos mediante filtración de membrana.
Siguiendo con el ejemplo, el Vs = 100 mL (ya que se trata de filtración).
Volumen total de muestra inoculado en las placas seleccionadas para el recuento (Vtot);
El número de placas seleccionado por dilución, siguiendo con el ejemplo, será n1 = 1, ya que se ha seleccionado una placa de una única dilución.
El volumen del inóculo aplicado a cada placa (ya que se trata de filtración) depende del volumen filtrado:
En este caso el volumen filtrado de cada muestra o dilución es de 100 mL por tanto, siguiendo con el ejemplo, será V1 = 100 mL
El nivel de dilución depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y será:
d=1; cuando la dilución menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (sólo para muestras líquidas o muestras de agua)
d=0,1;
cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la primera dilución, dilución 1/10 ó 10-1.
Y así sucesivamente.
Siguiendo con el ejemplo, será d1 = 1, ya que la placa seleccionada para realizar el recuento es las de la muestra sin diluir
Por tanto Vtot se calculará: Vtot= (n1V1d1 ) = (1*100*1) =100 mL
|
Por tanto tendremos:
Cs = (18,4/100)*100 = 18,4 UFC/100 mL. Redondeando: Cs = 1,8 x 10 UFC/100 mL
|
| Le aconsejamos (en el caso de no tener
experiencia previa en los cálculos y en la expresión de los resultados)
que se ejercite en la interpretación de estos ejemplos antes de contestar
a las preguntas del supuesto práctico, comprobando su correcta interpretación
haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que
le parezca correcta. |
| Ejemplo 1. Cálculo y expresión de resultados en un recuento mediante filtración de membrana en una muestra de agua de la red de distribución, donde no debemos realizar confirmación de las colonias. El volumen de muestra filtrada es de 100 mL tanto de la muestra sin diluir como de cada una de las diluciones ha sido de 100 mL. |
|
El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
| |
Sin diluir |
Dilución 10-1 |
Dilución 10-2 |
Dilución 10-3 |
| Número de Colonias |
>300 |
168 |
14 |
3 |
| >300 |
155 |
16 |
1 |
|
Preguntas
|
1. En este caso, qué diluciones utilizaría para realizar el recuento:
a) Dilución 10-1
b) Dilución 10-2
c) Dilución 10-1 y 10-2
d) Dilución 10-2 y 10-3
|
2. En este caso, el volumen de referencia (Vs) para expresar la concentración de micoorganismos será:
a) Por mililitro ya que se trata de un recuento en placa.
b) Por 0,1 mL ya que se trata de un recuento en placa mediante homogenización en masa.
c) Por 100 mL ya que se trata de un recuento por filtación de membrana.
|
3. El volumen total de muestra (Vtot) es:
a) Vtot= 22
b) Vtot= 20
c) Vtot= 2
|
4. Utilizando la siguiente expresión, el número de Unidades Formadoras de Colonias es:
a) Cs = 1.604,5 UFC/100 mL
b) Cs = 16.000 UFC/mL
|
5. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/100 mL como:
a) 1,6 x 103 UFC/100mL
b) 1,6 x 104 UFC/mL
|
| Ejemplo 2. Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante filtración de membrana en una muestra de agua embotellada, donde debemos confirmar si las colonias sospechosas son oxidasa positivas. El volumen de muestra filtrada es de 100 mL tanto de la muestra sin diluir como de cada una de las diluciones ha sido de 100 mL. |
|
El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
| |
Sin diluir |
Dilución 10-1 |
Dilución 10-2 |
| Número de Colonias |
25 típicas
96 totales |
1 típicas
12 totales |
0 típicas
3 totales |
|
Preguntas
|
1. En este caso, qué diluciones utilizaría para realizar el recuento:
a) Sin diluir
b) Dilución 10-1
c) Sin diluir y 10-1
d) Dilución 10-1 y 10-2
|
2. El número de colonias sospechosas confirmadas (x), si sometemos a confirmación a todas las colonias sospechosas y 18 son oxidasa positivas, es:
a) x =18
b) x =7
|
3. El volumen total de muestra (Vtot) es:
a) Vtot= 1
b) Vtot= 10
c) Vtot= 100
|
4. Utilizando la siguiente expresión y tras es redondeo, el número de Unidades Formadoras es:
a) Cs = 1,8 x 10 UFC/mL
b) Cs = 1,8 x 10 UFC/100 mL
|